研究背景:造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）是一类稀有的,具有自我更新能力,能分化为全系列血液细胞和免疫细胞并维持机体终生造血的多能干细胞。HSCs的生成发育过程受到各种信号通路和微环境中多种物理化学因素的调控。任一信号环节出现失衡或异常,都有可能导致HSCs发育障碍或功能缺陷,继而引发病态造血,甚至进展为造血系统恶性疾病。虽然早在五十多年前HSCs就已被发现并被广泛应用于包括白血病在内的多种血液疾病的移植治疗中,但目前在体外产生足够量具有长期造血重建功能的HSCs仍是一项尚未完成的任务,因而限制了其在临床上的有效应用,而其根本原因是我们对胚胎HSCs的生成发育过程和相应信号调控网络及分子机制的了解仍然不够全面。因此,对胚胎HSCs生成发育过程的动态调控机制的研究越是系统和完整,越有利于我们理解和治疗各类血液疾病以及早日实现体外诱导获得HSCs。长期以来,大多数关于HSCs发育和功能的研究常只关注生物化学信号的作用,直到近年,多个独立研究团队相继发文证实生物机械信号对胚胎HSCs的生成发育同样必不可少。胚胎HSCs的生成发育不仅需要细胞外部生物机械因素如血流机械力的刺激也涉及细胞内部力的作用,两者均与细胞骨架密切相关。因此我们推测细胞骨架及相关调控因子可能参与调控胚胎HSCs的生成发育。胶质成熟因子（glia maturation factor,gmf）是一类在细胞骨架重构过程中发挥重要作用的调节因子。脊椎动物表达胶质成熟因子g（glia maturation factorγ,gmfg）和胶质成熟因子β（glia maturation factor-β,gmfb）两种不同的gmf亚型。gmfb主要表达在神经系统而gmfg特异高表达于造血系统,包括成体HSCs中。在小鼠胚胎HSCs的生成部位背主动脉（dornal aorta,DA）区也能检测到gmfg的特异表达。此外,gmfg还调控多种成熟血液细胞的功能活动如成体T淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的迁移和粘附,提示gmfg在成体造血系统中的重要作用。然而,gmfg在胚胎HSCs生成、维持和分化中的功能及潜在调控机制尚未见报道。近年来,由于斑马鱼具备的繁殖量大,体外发育和早期胚胎透明,易于遗传改造修饰以及造血发育过程和关键信号通路与哺乳动物间高度保守等独特优势特征,已被广泛用于体内造血发育研究。因此,本研究拟以斑马鱼为主要实验模型,系统探索和阐明gmfg在胚胎HSCs生成发育中的作用和分子机制,为丰富脊椎动物HSCs调控网络提供新的视角。第一章gmfg调控胚胎造血干细胞生成发育目的:探究gmfg和gmfb在体外造血分化和胚胎造血发育中的动态表达变化。明确gmfg和gmfb在胚胎HSCs生成发育中的作用。方法:在人胚胎干细胞（human Embryonic Stem Cells,h ESCs）造血分化过程中通过q PCR检测gmfg和gmfb的动态表达;利用整胚原位杂交（Whole-Mount In Situ Hybridization,WISH）检测gmfg斑马鱼胚胎发育过程的时空表达;分选斑马鱼胚胎血管内皮细胞和造血内皮（hemogenic endothelium,HE）q PCR检测gmfg和gmfb的表达;通过使用阻止目的基因翻译和影响成熟剪接两种不同类型的靶向性Morpholinos（MOs）敲降gmfg;使用阻止目的基因翻译的MO敲降gmfb;利用WISH、荧光显微镜成像和激光共聚焦体层扫描成像,观察实验组和对照组胚胎在不同发育时间点DA腹侧壁runx1和cmyb的表达以及cmyb+kdrl+双阳性细胞数目,尾部造血组织（caudal hematopoietic tissue,CHT）cd41阳性细胞数目,胸腺rag1的表达以及全胚lcr阳性细胞数目和lyz阳性细胞数目;在p53突变体中显微注射两种不同类型的gmfg MOs检测DA区runx1和cmyb的表达;分别利用lcr:e GFP转基因鱼,l-plastin和mpx探针检测受精后24小时（24 hours post fertilization,24hpf）中间细胞团（intermediate cell mass,ICM）lcr阳性细胞数目,28hpf躯干部及尾部血岛（posterior blood island,PBI）区l-plastin和mpx的表达。结果:在h ESCs造血分化过程中,gmfg的表达随着h ESCs向造血分化发育成熟逐渐升高;与未分化h ESCs相比,gmfg在分化至第六天的HE（CD31+CD34+）中显著升高,而gmfb的表达在整个分化过程未见明显变化;WISH结果显示gmfg在斑马鱼胚胎发育中的时空表达模式与胚胎HSCs生成发育轨迹十分相似;两种gmfg MOs均能有效降低内源性gmfg的蛋白水平;敲降gmfg,36hpf胚胎DA区runx1和cmyb表达显著降低;24及28hpf DA区runx1表达也显著降低;48hpf DA区和52hpf CHT区cmyb的表达以及75-77hpf CHT区cmyb阳性细胞也明显减少;与对照组相比,敲降gmfb的胚胎DA区24hpf runx1和30hpf cmyb的表达未见明显变化;敲降gmfg,48hpf DA区腹侧壁内kdrl+cmyb+阳性细胞数目明显减少;受精后3天（3 days post fertilization,3dpf）CHT区cd41阳性细胞数目显著减少,尾部cd41阳性细胞比例下降为大约对照组的一半;4dpf胸腺区rag1表达明显减少甚至缺如,3dpf全胚lcr阳性细胞和lyz阳性细胞显著减少;与未注射p53突变体相比,注射了gmfg-atg MO和gmfg-sp MO的p53突变体DA区26hpf runx1和36hpf cmyb的表达缺失仍然明显;敲降gmfg后的胚胎24hpf ICM区lcr阳性细胞以及28hpf胚胎躯干部及PBI区l-plastin和mpx的表达明显减少。结论:敲降gmfg后EHT受阻,HSCs生成缺陷,维持和分化也出现障碍,说明gmfg对胚胎HSCs的生成、维持和分化都是必要的;敲降gmfb不影响HSCs的生成发育;利用MOs敲降gmfg导致的HSCs生成发育缺陷不依赖于p53通路的非特异性激活;gmfg也参与调控原始造血过程。第二章gmfg对造血干细胞凋亡和增殖,PLM形成和动脉发育的作用目的:探索gmfg是否通过影响HSCs凋亡和增殖,胚胎早期后侧中胚层（posterior lateral mesoderm,PLM）形成以及动脉发育间接调控HSCs的生成发育。方法:利用TUNEL免疫荧光法检测DA区细胞凋亡;利用p H3免疫荧光法检测DA区细胞增殖;利用fli1a探针原位杂交检测12hpf PLM的形成;利用标记动脉的ephrin B2a和dlc探针检测动脉发育情况。结果:与对照组相比,gmfg-atg MO和gmfg-sp MO组26及32hpf DA区fli1a+TUNEL+双阳性凋亡细胞并见明显变化;26及36hpf DA区fli1a+p H3+双阳性增殖细胞也未见明显变化;12hpf胚胎fli1a的表达未见明显差异;与对照组相比,gmfg-atg MO组28hpf躯干部ephrin B2a和dlc的表达明显减少。结论:敲降gmfg后HSCs的凋亡与增殖以及胚胎早期PLM形成未受影响,提示gmfg调控HSCs的发育是独立于这些过程的,但动脉发育缺陷,因此不能排除gmfg因为影响了动脉发育继而影响HSCs发育的可能性。第三章:gmfg介导血流对造血干细胞维持的作用目的:探索在胚胎HSCs维持过程中gmfg与血流信号的功能关系及潜在分子机制。方法:利用同源重组的方法将斑马鱼胚胎gmfg基因编码序列（coding sequence,CDS）构建到PCS2+质粒上,然后用Not I限制性核酸内切酶单酶切该质粒使其线性化,线性化后的质粒作为模板体外转录合成gmfg-m RNA;gmfg-m RNA按照50ng/μl、100ng/μl、150ng/μl和200ng/μl的浓度梯度共四组与gmfg-atg MO共注射至胚胎单细胞内,注射体积均为1nl,然后收集28hpf的胚胎进行runx1/cmyb原位杂交,探索过表达gmfg的最优作用浓度;参考已发表文献定制tnnt2a-MO用于阻断血流构建静止心脏（silent heart,sih）模型,然后利用流式细胞术分选kdrl+cmyb+HE细胞,q PCR检测阻断血流后gmfg在HE中的转录水平变化,解剖分离出躯干和尾部提取蛋白检测阻断血流后gmfg的蛋白水平变化;将100ng/μl的gmfg-m RNA与tnnt2aMO共注射至胚胎单细胞内,原位杂交检测36hpf runx1/cmyb和48hpf cmyb的表达变化以及利用cd41:e GFP转基因鱼观察过表达gmfg是否可以拯救血流缺失导致的runx1和cmyb表达缺陷以及CHT区cd41阳性细胞减少;敲降gmfg后q PCR、western blot以及原位杂交检测klf2a、yap以及yap信号下游靶基因的表达变化;利用gmfg sh RNA在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）上敲降gmfg,分别检测细胞核和细胞质内YAP蛋白表达水平的变化以及细胞内CTGF蛋白表达水平的变化。结果:体外转录合成gmfg-m RNA并通过原位杂交实验确定过表达gmfg的最优注射浓度为100ng/μl,注射体积为1nl,因为该浓度足以拯救敲降gmfg引起的DA区runxl/cmyb表达水平的降低而同时不引起胚胎明显畸形;阻断血流后gmfg在48hpf HE的转录水平和躯干及尾部的蛋白水平均明显减少;过表达gmfg可以部分拯救血流缺失引起的36hpf runx1/cmyb和48hpf cmyb表达缺陷以及CHT区cd41阳性细胞减少;gmfg缺失胚胎klf2a的表达未受影响;敲降gmfg未引起yap的转录水平和蛋白水平变化,但引起了HE内yap信号下游靶基因ctgfa和cyr61的转录水平明显降低以及躯干和尾部CTGF的蛋白水平显著减少;在HUVEC内敲降gmfg,YAP在细胞核内的蛋白表达量减少而在细胞质内的蛋白表达量增多,细胞内CTGF的蛋白表达量也明显减少。结论:血流是gmfg调控HSCs维持的上游信号;gmfg通过影响YAP入核介导血流对HSCs维持的调控。第四章gmfg通过Notch信号调控造血干生成目的:探索在胚胎HSCs生成过程中gmfg与经典造血调控通路Notch,Hedgehog,BMP和c AMP信号的上下游功能关系。方法:参考已发表文献定制Notch,Hedgehog,BMP和c AMP通路的靶向抑制剂或激动剂,在胚胎发育至12-14hpf加于holt buffer,联合或不联合过表达gmfg或敲降gmfg处理,对照组则使用与实验组相同的0.1%的DMSO,收集28-30hpf胚胎原位杂交检测runx1/cmyb的表达;在Notch信号报告模型tp1:GFP中敲降gmfg,观察DA区tp1信号的变化,同时流式分析对照组和敲降组tp1阳性细胞的比例变化;进一步利用tp1:m Cherry与fli1a:e GFP双转基因胚胎观察DA区fli1a+tp1+双阳性细胞数目的变化;利用流式细胞术分选kdrl+cmyb+HE细胞,q PCR检测Notch信号下游靶基因hey1和hey2的表达变化;在hsp70l:Gal4和UAS:NICD杂交胚胎中注射control或gmfg-atg MO,待胚胎发育至12-14hpf时将其置于38℃恒温箱内1h热激处理,然后收集28hpf胚胎原位杂交检测runx1的表达。结果:过表达gmfg不足以拯救Hedgehog,BMP和Notch通路受抑制导致的DA区runx1/cmyb表达缺陷;激活c AMP通路也不足以拯救因gmfg缺失导致的runx1/cmyb表达缺陷;与对照组相比,敲降gmfg的胚胎30hpf DA区tp1信号的表达较弱且不连续,整胚tp1+细胞比例显著下降;28hpf胚胎DA区tp1+kdrl+双阳性细胞数目明显减少,48hpf kdrl+cmyb+HE内notch信号靶基因hey1和hey2的表达明显减少;敲降gmfg的胚胎28hpf DA区runx1阳性细胞显著减少,而敲降gmfg的同时过表达NICD能部分拯救因gmfg缺失导致的runx1阳性细胞减少的表型。结论:在胚胎HSCs生成过程中gmfg是Notch信号的上游调控分子;Hedgehog和BMP信号与gmfg可能相互独立,或可能是gmfg的下游信号;c AMP信号与gmfg可能相互独立,或者是gmfg的上游信号。