动物乳腺生物反应器是利用转基因技术将外源基因导入动物基因组中并获得乳腺特异性表达目的蛋白转基因动物的一项技术,目前已有多种相关的医药蛋白产品获批上市,创造了巨大的经济价值,其中奶山羊由于大小合适、妊娠期短和乳汁分泌丰富的特点在乳腺生物反应器中广泛应用。但是目前制备转基因动物的技术仍不成熟,利用体细胞核移植技术获得的转基因动物怀孕率低、死亡率高以及位置效应导致的低表达等因素,都严重影响了动物乳腺生物反应器的应用和发展。基于此,选择高效的基因打靶技术和安全的打靶位点是保证目的蛋白在乳腺中高效表达以及提高转基因动物制备效率的重要因素。高效率、低成本和操作简便的CRISPR/Cas9技术是继ZFNs和TALENs之后出现的第三代基因编辑技术,已在多物种广泛应用,ROSA26基因座则是目前被认为最接近基因插入安全港定义的一个多物种均可整合外源基因的友好位点。本研究首次利用CRISPR/Cas9技术对奶山羊原代细胞的gROSA26基因座进行不同策略的基因打靶,旨在获得一种能够更高效安全制备奶山羊乳腺反应器的基因打靶系统。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞(goat mammary epithelial cell,g MECs)为试验材料,利用RACE技术获得gROSA26转录本序列,通过鉴定核心启动子区域及其启动强度确定了其启动筛选标记基因获取单克隆细胞的可能性。随后利用sgRNA设计网站CRISPOR在gROSA26的第1内含子区域筛选潜在脱靶位点最少的打靶位点,SSA双荧光检测不同位点的体外切割效率得到具有较高打靶效率和较低脱靶效率的sgRNA。进一步利用不同DSB修复机制构建HDR、HMEJ、NHEJ、MMEJ四种供体载体报告质粒,分别和Cas9打靶载体共转染至奶山羊乳腺上皮细胞筛选内源启动子启动筛选标记基因表达的阳性克隆,确认HMEJ策略下的打靶效率最高。最后构建gROSA26内源启动筛选标记以及乳腺特异性启动人溶菌酶的HMEJ供体载体,筛选人溶菌酶基因在gROSA26位点定点整合的阳性克隆,从而获得了一种外源基因整合效率更高并且表达更稳定的CRISPR/Cas9基因打靶系统,也为后续利用奶山羊乳腺生物反应器生产医药蛋白的规模化应用奠定了基础。