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新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome,RDS)是由于肺泡II型上皮细胞(alveolar type II cells,AT-II)合成肺表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)不足所导致的早产儿特发疾病,表现为新生儿出生不久即出现的进行性呼吸窘迫和呼吸衰竭,具有很高的发病率和病死率,严重影响新生儿的生存质量及预后。本文主要目的是研究新生儿呼吸窘迫综合征的发生机制,探索PS的合成过程,并期望为该疾病的防治提供新的干预靶点。文献表明,PS的合成及分泌受到多种因素的影响与调节,其中,MicroRNAs(miRNAs)的作用越来越受到关注。miR-20a-5p是课题组前期通过基因芯片技术筛选出来的一条miRNA,芯片结果显示miR-20a-5p在胎鼠肺发育过程中随胎龄增加逐渐下调。另外,芯片结果也显示其在RDS患儿与对照患儿外周血中差异表达,RDS患儿的miR-20a-5p显著下调。因此我们推测miR-20a-5p可能在肺发育及RDS的发生发展过程中发挥一定作用。本研究分两个部分,第一部分通过实时定量PCR验证miR-20a-5p的差异表达,并对其进行生物信息学分析,了解其基本生物特征。第二部分在胎鼠肺泡II型上皮细胞中探讨miR-20a-5p对PS表达的调控作用及其机制。第一部分miR-20a-5p的差异表达及基本生物特征目的:了解miR-20a-5p在胎鼠肺发育过程及其RDS患儿血浆中的表达,对miR-20a-5p进行生物信息学分析,为探讨miR-20a-5p在肺发育中的生物学功能提供理论依据。方法:通过实时定量PCR检测miR-20a-5p在孕16、19、21天胎鼠肺组织,以及在RDS患儿和对照患儿血浆中的表达;采用miRBase检索miR-20a-5p的序列特征,分析其物种保守性;运用Targetscan等数据库进行其靶基因预测,并通过DAVID数据库对其靶基因进行GO(功能富集)及pathway分析(信号通路分析)。结果:miR-20a-5p在孕16、19、21天胎鼠肺组织中的表达水平逐渐下降;与对照患儿相比,miR-20a-5p在RDS患儿血浆中表达下调;miR-20a-5p的序列在多物种间高度保守,其靶基因存在于各个细胞组分中,其功能包括转录调控、蛋白质修饰、细胞增殖、凋亡、分化以及激酶活性调节等,信号通路显著富集于PI3K-Akt、MAPK、TGF-b等信号通路。结论:miR-20a-5p在肺发育过程中差异表达,并可能参与RDS的发生发展,为其在肺发育相关的生物学功能及调控机制的研究提供理论依据及实验基础。第二部分mi R-20a-5p对肺泡上皮细胞肺表面活性物质相关蛋白表达的调控作用与机制目的:Micro RNA(mi RNA)在许多生物过程中调控基因的表达,包括肺发育和肺表面活性物质的生物合成。本研究旨在探索mi R-20a-5p在肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type II cells,AT-II)对肺表面活性物质表达的调控作用及机制。方法:从孕19天大鼠胎鼠的肺组织中分离、纯化AT-II进行培养,将构建的过表达、沉默mi R-20a-5p以及阴性对照的腺病毒转入原代细胞,通过荧光显微镜观察病毒载体携带的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的荧光判断转染效率,通过实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,q PCR)检测mi R-20a-5p的表达水平。采用CCK-8试剂法检测AT-II的增殖情况,通过q PCR和Western blot检测肺表面活性物质相关蛋白(surfactant associated proteins,SPs)和同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)的表达情况。结果:转染过表达mi R-20a-5p腺病毒48h后,可见90%以上的AT-II表达GFP,过表达组mi R-20a-5p的表达水平较阴性对照组(NC)明显上调(P<0.05)。q PCR和Western blot的结果显示过表达组SPs(SP-A,SP-B,SP-C,SP-D)的m RNA和蛋白的表达均升高(P<0.05),而PTEN的表达下降(P<0.05)。沉默mi R-20a-5p后,与NC组相比,沉默组SPs的表达下降(P<0.05),PTEN的表达升高(P<0.05)。无论过表达组还是沉默组,细胞的增殖情况无明显变化(P>0.05)。结论:mi R-20a-5p在AT-Ⅱ细胞的增殖中不起作用,但对肺表面活性物质相关蛋白的基因表达具有调控作用,这种调控作用可能是通过调节靶基因PTEN的表达来实现的。