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乙酸与甘油是酿酒酵母乙醇发酵过程主要的副产物。本研究通过敲除酿酒酵母Y01乙醛脱氢酶ALD4基因,获得了ALD4基因缺失的突变体DY01；通过构建反义表达载体抑制酿酒酵母甘油脱氢酶关键基因GPD1的转录,以促进乙醇发酵。结果如下：1.采用以PCR为基础的loxP-KanMX-loxP序列组件和Cre/loxP删除系统删除了酿酒酵母工程菌Y01乙醛脱氢酶ALD4基因,获得突变株DY01；酿酒酵母ALD4缺失菌株DY01发酵液乙醇比出发菌株酿酒酵母Y01提高了6.88%。2.通过构建酿酒酵母实验菌株INVScl甘油脱氢酶GPD1基因5’UTR反义表达载体pYES2.0-GPD1,实验组比对照组的3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)的比活力最大下降了24.03%；甘油产量含量下降幅度最大达到了25.43%,而且甘油含量的下降滞后于3.磷酸甘油脱氢酶活性的下降。3.通过构建酿酒酵母突变株DY01甘油脱氢酶GPD1基因5’UTR反义表达载体pYES2.0-GPD1/KanMX,获得酿酒酵母DRY01菌株；酿酒酵母DRY01菌株的甘油脱氢酶(GPDH)的比活力比出发菌株DY01下降了20.04%；甘油含量下降幅度最大达到了19.14%；同时,酿酒酵母DRY01发酵液乙醇含量比酿酒酵母DY01提高了9.74%,比原始菌株Y01乙醇含量提高了14.01%。建立在酵母高效同源重组机制的loxP-KanMX.loxP删除组件与Cre/loxP系统是进行酿酒酵母基因改良育种与酿酒酵母基因功能相关研究的有效方法,突破了工业酿酒酵母缺乏有效选择标记与遗传多样性的限制。酿酒酵母ALD4基因的缺失,有利于乙醇代谢途径。酿酒酵母工程菌株DY01 GPD1基因mRNA 5’UTR的反义RNA能够有效的抑制酿酒酵母工程菌株DY01GPD1基因的转录,触发沉默该基因的表达；为提高甘蔗等生物质发酵燃料乙醇效率迈出重要一步,为酿酒酵母工程菌的基因改良奠定了基础。