目的:神经再生尤其是中枢神经轴突再生一直是临床研究的一个难题。轴突作为神经元的输出通道,在细胞信号传递的过程中起着极其重要的作用。当脊髓损伤后,神经轴突受损,信号无法传递,导致患者感觉和运动功能丧失。由于损伤后的神经自身再生能力弱以及周围存在抑制性微环境,神经轴突往往不能再生。因此,在神经系统的修复过程中,轴突再生是解决问题的一个关键步骤。脊髓前角运动神经元为皮质脊髓束(Corticospinal tract,CST)传导通路的下级运动神经元,与皮质脊髓束一同控制肌肉的随意运动,在脊髓信号传导过程中起着至关重要的作用。但到目前为止,我们尚未发现有脊髓前角运动神经元轴突再生模型建立的相关研究。因此,本课题利用Rosa-tdTomato+/-基因鼠和AAV-Cre病毒建立一种脊髓前角运动神经元轴突再生模型,为研究脊髓前角运动神经元轴突再生提供一种实验工具。方法:我们以Rosa-tdTomato+/-基因鼠为实验对象,向小鼠脊髓前角内注射AAV-Cre病毒,病毒感染的细胞会表达tdTomato荧光蛋白。(1)取基因鼠脊髓、DRG、坐骨神经和肌肉进行冰冻切片,对脊髓前角运动神经元胞体和轴突进行特异性免疫荧光染色,观察tdTomato荧光蛋白在神经元中的表达。(2)为了统计tdTomato阳性轴突在坐骨神经中的比例,坐骨神经横向切片免疫荧光染色Tuj-1和ChAT,统计轴突数目。(3)脊髓前角内注射AAV-Cre病毒,同时L3-L4 DRG电穿孔转染EGFP质粒,4天后坐骨神经夹伤,第7天取坐骨神经进行压片,分别测量坐骨神经中感觉和运动神经元轴突再生的长度。(4)Rosa-tdTomato+/-基因鼠与 PTENflox/flox基因鼠进行交配,获得Rosa-tdTomato+/-;PTENflox/flox基因鼠。同时对 Rosa-tdTomato+/-基因鼠和Rosa-tdTomato+/-;PTENflox/flox基因鼠进行脊髓完全损伤手术和前角内注射AAV-Cre病毒手术,4周后取脊髓进行冰冻切片,观察tdTomato阳性轴突的生长情况。脊髓切片免疫荧光染色vGlut 1检测突触囊泡。BMS评分评估前角运动神经元轴突再生对脊髓损伤小鼠运动功能的影响。结果:(1)AAV-Cre病毒成功注射到脊髓前角内,tdTomato荧光蛋白标记脊髓前角运动神经元。(2)tdTomato阳性轴突数目占坐骨神经中总轴突数目的25.6%±2.42,占坐骨神经中总运动神经元轴突数目的72.6%±2.91。(3)坐骨神经中运动神经元轴突的再生长度明显短于感觉神经元轴突的再生长度。(4)Rosa-tdTomato+/-;PTENflox/flox基因鼠前角运动神经元敲除PTEN基因后轴突穿过脊髓损伤位点,再生轴突末端与vGlut 1阳性斑块重合,重塑突触结构。BMS评分,相对于Rosa-tdTomato+/-基因鼠,Rosa-tdTomato+/-;PTENflox/flox基因鼠的运动功能相对得到改善,但不具有统计学意义。结论:成功的建立了脊髓前角运动神经元轴突再生模型,为研究脊髓前角运动神经元轴突再生提供一种实验工具。