【摘 要】
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目的:顺铂作为一种常见的抗肿瘤药物,可治疗多种恶性肿瘤,但其耳毒性、肾毒性及神经毒性等副作用成为了其在临床应用的阻碍。目前普遍认为,顺铂耳毒性损伤的机制主要是氧化应激、DNA损伤和内质网应激导致。大量研究证明核因子红系2相关因子2（Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2）在顺铂耳毒性中发挥保护作用。目前已有新的研究表明顺铂可以通过铁死亡方式诱导体内外毛细胞发
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目的:顺铂作为一种常见的抗肿瘤药物,可治疗多种恶性肿瘤,但其耳毒性、肾毒性及神经毒性等副作用成为了其在临床应用的阻碍。目前普遍认为,顺铂耳毒性损伤的机制主要是氧化应激、DNA损伤和内质网应激导致。大量研究证明核因子红系2相关因子2（Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2）在顺铂耳毒性中发挥保护作用。目前已有新的研究表明顺铂可以通过铁死亡方式诱导体内外毛细胞发生凋亡,所以本实验研究目的是探讨Nrf2在顺铂诱导的毛细胞铁死亡中的作用机制,尝试为顺铂诱导的耳毒性损伤机制提供新的思路。方法:首先我们使用顺铂在HEI-OC1细胞中建立顺铂耳毒性的细胞损伤模型。用CCK-8法检测不同剂量顺铂处理HEI-OC1细胞24h后细胞活性的变化以及不同浓度铁死亡抑制剂（Fer-1）预处理毛细胞2h之后与30u M顺铂共培养24h细胞的活性影响。使用Fe2+检测试剂盒及GSH检测试剂盒检测有或无Fer-1预处理2h后,顺铂共处理24h,HEI-OC1细胞内铁离子累积及GSH消耗情况。其次我们使用实时定量聚合酶链反应（RT-q PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）检测不同浓度顺铂处理对HEI-OC1细胞后核因子红系2相关因子2（NRF2）m RNA、蛋白表达变化。随后NRF2激动剂叔丁基对苯二酚（Tert-butyl hydroquinone,TBHQ）预处理HEI-OC1细胞24h后,与50u M顺铂共培养24h,CCK-8法、Fe2+检测试剂盒检测各组HEI-OC1细胞活性及铁离子累积现象的影响。最后使用RT-PCR技术检测TBHQ预处理加顺铂共培养后HEI-OC1细胞中NRF2、TFR1、FTH1的表达情况。结果:CCK-8结果显示,不同浓度顺铂处理HEI-OC1细胞,细胞活性明显低于阴性对照组,且顺铂对细胞活性的抑制能力呈剂量依赖性（P＜0.001）;用不同浓度Fer-1预处理HEI-OC1细胞2h接着用50u M顺铂共培养24h,Fer-1可以明显升高顺铂作用后细胞活力（P＜0.001）,且浓度越高作用越强。Fe2+及GSH检测结果显示,单纯顺铂处理HEI-OC1细胞中Fe2+含量明显高于对照组（P＜0.05）,GSH水平显著降低（P＜0.01）;而Fer-1预处理组HEI-OC1细胞Fe2+含量均有明显降低（P＜0.05）。RT-PCR和Western blot实验显示,单纯顺铂处理组的NRF2的m RNA显著低于对照组（P＜0.001）,蛋白表达量呈先升高后显著降低的趋势。我们使用TBHQ之后,TBHQ+顺铂组HEI-OC1细胞活性明显高于单纯顺铂处理组（P＜0.01）;Fe2+检测显示,TBHQ+顺铂组细胞内Fe2+积累显著降低（P＜0.05）。RT-PCR结果显示,与对照组相比,单纯顺铂组的NRF2、FTH1表达下降,TFR1则显著升高（P＜0.001）;与单纯顺铂组相比,TBHQ+顺铂组的NRF2、FTH1进一步升高（P＜0.01）,而TFR1的蛋白表达量则相对降低（P＜0.05）。结论:实验提示,顺铂能引起耳蜗毛细胞系（HEI-OC1）发生铁死亡现象。其过程主要是Fe2+积累,GSH耗竭引起的。进一步检测其机制,发现顺铂能下调HEI-OC1细胞中NRF2蛋白的表达,NRF2的下调减弱了细胞抗氧化应激防御系统。使用Nrf2激动剂TBHQ之后使顺铂引起的细胞毒性作用减弱,细胞活性增强,Fe2+积累量出现保护性的降低;上调了FTH1但下调了TFR1的表达。以上结果提示顺铂通过抑制NRF2表达调节细胞铁稳态引起HEI-OC1细胞铁死亡现象。
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