论文部分内容阅读
干扰素刺激基因15（Interferon stimulated gene15，ISG15）编码的ISG15蛋白作为抗病毒天然免疫反应中重要的一员，参与肿瘤免疫应答、细胞凋亡、细胞因子表达、转录调控等多种生物学过程。作为ISG家族中第一个被鉴定的类泛素蛋白，与泛素相似，ISG15可通过酶级联反应与靶蛋白共价结合。目前已证实ISG15的靶蛋白已超过上百种。研究表明，人源和鼠源ISG15具有抗病毒作用和调控干扰素信号通路的作用，但猪源ISG15的作用尚不清楚。本研究旨在克隆表达猪ISG15，制备多克隆血清，构建稳定表达猪ISG15基因的PK-15细胞系，并以此为基础进一步探究猪ISG15抑制伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的作用，以期探究猪ISG15的功能，并为PR的防控提供新的思路。 1.猪ISG15蛋白的表达及多克隆抗体的制备 从家猪外周血液淋巴细胞中抽提总RNA，通过反转录获得cDNA，利用GcncBank中公布的野猪ISG15的基因序列设计引物，扩增出猪ISG15基因，测序后，通过生物信息学软件对其进行分析。ISG15基因片段与pET28a载体连接，构建重组原核表达质粒pET28a-pISG15，转化至BL21，经IPTG诱导表达后，通过N1柱纯化，获得ISG15蛋白。用重组的ISG15蛋白免疫家兔，制备多克隆血清。结果表明，猪ISG15基因CDS区长504bp，编码167个氨基酸，包括两个泛素样结构域:N端的第3～75位氨基酸肽段，C端的第81～156位氨基酸肽段，及其C末端核心序列LRLRGG。Western blot分析结果表明，重组ISG15蛋白的免疫原性良好，ELISA方法测定结果显示，血清抗体效价为1∶102400。此试验为猪ISG15功能的进一步探究奠定基础。 2.稳定过表达猪ISG15基因PK-15细胞系的构建 将猪ISG15基因克隆于PiggyBac真核转座子系统中，成功构建PiggyBac-pISG15重组真核表达载体，并通过转染的方法将猪ISG15基因转入PK-15细胞，使用浓度为5ug/mL的嘌呤霉素初步筛选两周后，然后通过有限稀释法克隆出稳定表达绿色荧光蛋白的稳定转染细胞系。通过荧光定量PCR和Western blot检测猪ISG15基因在稳定转染细胞系中表达的情况。结果显示，与空载体对照组细胞相比，稳定转染细胞系绿色荧光蛋白的表达稳定，猪ISG15基因表达量增加9倍左右，连续传代15代，ISG15的表达量依然稳定，说明稳定表达猪ISG15基因的PK-15细胞株构建成功，命名为PI-15。此试验为进一步探究猪ISG15的功能提供了有效工具。 3.猪ISG15对PRV复制的影响 为研究猪ISG15对PRV的影响，本试验将PRV＿QXX株接种于稳定表达猪ISG15的PK-15细胞系（PI-15），分别在接毒后12h、24h、36h和48h收毒，通过荧光定量PCR和蚀斑试验方法检测PRV的基因相对表达量和病毒滴度。针对猪ISG15保守序列设计siRNA，利用RNAi技术敲减过表达细胞系中ISG15的表达，在PRV感染情况下，通过荧光定量PCR和蚀斑试验方法检测PRV基因的相对表达量和病毒滴度，反向验证猪1SG15对PRV的影响。结果显示，与空载体对照组细胞相比，在接毒24h时，猪ISG15过表达细胞抑制病毒的基因表达量达5倍以上，病毒滴度下降了约5倍;ISG15的表达被敲减后，其对PRV复制的抑制作用几乎消失，反向验证了猪ISG15具有抑制PRV复制的作用。本试验为猪PRV的防治提供新的思路。 4.猪ISG15对干扰素及相关因子的影响 为探究猪ISG15对干扰素信号通路的影响，本试验构建了重组载体pCAGGS-HA-pISG15，利用双荧光素酶报告系统检测猪ISG15对猪IFN-β启动子活性的影响，并利用过表达ISG15细胞系，通过荧光定量PCR和ELISA检测ISG15对猪IFN-β及其他几种细胞因子表达的影响。结果显示，猪ISG15可以激活猪IFN-β启动子，细胞感染PRV前后，过表达ISG15均可上调IFN-β、OAS和IL-8的mRNA水平。本试验为进一步探究ISG15抑制PRV复制的分子机制提供基础。