论文部分内容阅读
2020年至今,由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发的新冠肺炎（COVID-19）波及全球,确诊人数持续增加,在造成人员死亡和经济损失的同时,也产生了严重的社会恐慌,已构成“国际关注的突发公共卫生事件”。SARS-CoV-2较强的传染性、突变性和致病性,以及COVID-19成熟治疗、预防手段的缺乏,给疫情防控工作带来了巨大的挑战。作为疫情防控工作的第一步,快速准确的诊断技术有利于对散发病例的“早发现”以及对密切接触者、通关入境者等重点人群的筛查,从而有效控制疫情蔓延。COVID-19疫情暴发后,逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）核酸检测试剂的迅速上市和临床应用在患者临床诊断和疑似患者排查中发挥了重要作用,然而,传统核酸检测手段受流程繁琐,操作复杂,需要集中送检等限制,不仅耗时较长,且需要专业仪器检测、专业人员操作,这使得核酸检测在时间、地点方面受到了限制。为推动COVID-19诊断的前移下移,摆脱现有检测技术对专业核酸检测设备的依赖,实现疑似患者和密切接触人群的快速诊断,研发无需专业检测设备的核酸检测技术势在必行。近年来,CRISPR技术迅猛发展,不仅被广泛应用于基因编辑领域,还被开发出一系列CRISPR分子诊断技术。该技术利用CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）的附属切割活性,结合等温扩增技术,不仅具有快速、高灵敏、高特异的特点,还可通过侧向流层析试纸、溶液颜色变化等方式满足脱离实验室的现场快速核酸检测需求。作为目前最常用的现场检测方式,CRISPR侧向流层析试纸根据胶体金颗粒显现条带的数量及位置判断是否含有相应物质,无需仪器设备即可直观展现CRISPR检测结果,具有快速、廉价、便携的特点。本研究基于CRISPR-Cas13a核酸检测技术原理,结合逆转录重组酶介导的等温扩增技术（RT-RAA）以及免疫层析技术,通过对已有侧向流层析试纸中主要成分浓度的调整,研发了一种易判读、高灵敏的（Easy-Readout And Sensitive Enhanced,ERASE）核酸检测试纸,与原有侧向流层析试纸相比,ERASE试纸灵敏度更高、判读方式更客观。此外,本研究利用ERASE试纸建立了针对SARS-CoV-2的现场核酸检测技术,进一步利用来自646位受试者的649例临床样本证明了ERASE方法检测结果与临床诊断和RT-qPCR方法检测结果良好的一致性,为推动COVID-19诊断的前移下移提供了新方法。1.CRISPR“消线法”核酸检测试纸（ERASE试纸）的研发针对已有侧向流层析试纸灵敏度和判读客观性方面的不足,本研究结合RT-RAA等温扩增技术和CRISPR-Cas13a核酸检测技术,调整了试纸中主要成分的浓度,筛选了报告RNA种类,优化了CRISPR体系组成成分用量以及各主要步骤反应条件,结果显示,当使用0.4 mg/m L的胶体金、16μg/m L的兔源抗FITC、0.8 mg/m L的链霉亲和素时,搭配20U的报告RNA,可在37～42℃、1小时左右的条件下,以T线的完全消失作为阳性结果的判读标准,实现对低至1拷贝/μL阳性核酸的特异性（单碱基）检出,其灵敏度优于已有侧向流层析试纸（10拷贝/μL）。以上结果表明,基于CRISPR的“消线法”核酸检测试纸（ERASE试纸）与已有侧向流层析试纸相比,不仅具有更高的灵敏度,而且判读方式更具客观性。此外,本研究基于ERASE试纸建立了判读客观、灵敏特异、现场化CRISPR核酸检测技术（ERASE检测）。2.基于ERASE的SARS-CoV-2核酸检测方法建立针对脱离实验室的现场快速核酸检测需求,本研究通过序列比对分析,在SARS-CoV-2 N基因中获得了一段合适的cr RNA靶序列,该序列具有较高的保守性（完全匹配率为99.81%）和特异性（能区分10种相近冠状病毒）;通过引物筛选,获得了可以高效扩增上述cr RNA靶序列所在区域的RT-RAA引物对,并利用该cr RNA和RT-RAA引物对建立了基于ERASE的SARS-CoV-2核酸检测方法;利用不同浓度的SARS-CoV-2标准物质（RNA）评价了ERASE方法的灵敏度,结果显示,ERASE方法可以稳定检出1拷贝/μL的SARS-CoV-2 RNA（5/5）,在灵敏度方面接近于RT-qPCR方法（0.5拷贝/μL）;利用其他6种可感染人的冠状病毒核酸和2种来自蝙蝠的冠状病毒核酸评价了ERASE方法的特异性,结果显示,ERASE方法在检测其他8种冠状病毒过程中未产生交叉反应。以上结果表明,基于ERASE的SARS-CoV-2核酸检测方法具有良好的灵敏度和特异性,可以实现对SARS-CoV-2的高灵敏、高特异、现场化检测。3.SARS-CoV-2 ERASE方法的临床评价为进一步评价SARS-CoV-2 ERASE方法的检测效果,本研究利用ERASE方法和RT-qPCR方法分别检测来自4家临床机构646位受试者的649例临床样本,结果显示,与临床诊断相比,ERASE方法的临床灵敏度为91.67%,临床特异度为99.21%,临床总体符合率为96.13%;与RT-qPCR检测结果相比,ERASE方法的阳性符合率为92.02%,阴性符合率为99.22%,总体符合率为96.30%;在对其中53例弱阳性样本的检测中,ERASE方法表现出的综合临床符合率为84.91%,且可检出的弱阳性样本中Ct最高值为39.83,接近于RT-qPCR的阳性判断值（Ct值≤40）;在对其中165例痰液样本的检测中,ERASE方法表现出的临床灵敏度为94.67%,高于其在检测484例咽拭子样本时表现出的90.48%,且可完全检出Ct值<35的痰液样本。以上结果表明,SARS-CoV-2 ERASE方法的检测结果与临床诊断和RT-qPCR方法的检测结果均表现出良好的一致性。综上,本研究基于侧向流层析试纸研发了一种适用于CRISPR的“消线法”核酸检测试纸（ERASE试纸）,该试纸在提高CRISPR现场核酸检测灵敏度的同时改善了判读方式的客观性。此外,本研究通过结合CRISPR-Cas13a核酸检测技术和RT-RAA等温扩增技术,建立了以ERASE试纸为结果呈现方式的判读客观、灵敏特异、现场化CRISPR核酸检测技术（ERASE检测）,并将该技术应用于SARS-CoV-2的检测中,ERASE方法在检测来自646位受试者的649例临床样本中表现出与临床诊断和RT-qPCR方法良好的一致性,摆脱了核酸检测对荧光检测设备的依赖,缩短了检测用时,提升了便捷程度,为推动COVID-19诊断的前移下移提供了技术支撑,也为基层医疗机构及发展中国家提供了可快速部署的大范围核酸检测能力。