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研究背景与目的:肺癌是全球最致命的恶性肿瘤,而放射治疗(radiotherapy,RT)是其重要的治疗手段之一。DNA损伤应答过程(DNA damage response,DDR)是影响肿瘤细胞放疗反应的重要因素。许多研究都表明,改变DNA损伤应答基因的表达水平可以起到调控细胞放疗敏感性的作用。其关键蛋白ATM、Ku70、Ku80等蛋白也曾被报道与肿瘤患者的放疗预后相关。作为一种内源性非编码RNA分子,微小RNA(microRNA)能通过与靶基因的3’UTR结合,导致靶基因m RNA的降解或抑制其翻译,下调靶基因的蛋白的表达。其参与调控多种生理过程,也与肿瘤疾病的发生、发展、转移等病理过程密切相关,亦有许多文献证实了miRNA能够调控肿瘤细胞的放疗敏感性。报道显示,MiR-384在多种肿瘤中呈差异性表达,一些新近研究揭示了其在肝癌及脑胶质瘤的发生发展中的作用,然其在肺癌中的机制尚不清楚。本研究在分子、细胞等多水平阐释了miR-384在DNA损伤应答通路中的作用,旨在为DNA损伤应答的机制研究提供些许补充,为NSCLC的临床个体化治疗寻找新的潜在靶点、提供新的研究思路。研究方法:1.miR-384在NSCLC中的表达情况及其对放疗敏感性的影响:利用荧光实时定量技术(RT-PCR)检测miR-384在NSCLC细胞中的表达。利用Crispr/cas9技术建立miR-384敲除型(knockout)细胞系。利用慢病毒载体建立miR-384过表达细胞系。利用克隆形成实验检测miR-384对NSCLC细胞的放疗敏感性的影响。miR-384调控NSCLC细胞放疗敏感性的具体机制:使用miRbase、Target Scan等生物学网站预测miR-384的靶基因并通过双荧光素梅报告试验、免疫印迹(western blotting,WB)、RT-PCR技术进行验证;利用免疫荧光实验、WB、FITC-Annexin V/PI流式细胞术等检测miR-384对DNA损伤应答信号通路的影响。2.miR-384的上游调控机制:使用启动子分析预测miR-384的潜在转录因子。利用RT-PCR及western blotting验证miR-384受其调控的真实性。利用染色质免疫共沉淀(ChIP)测定相应转录因子是否与miR-384启动子区域结合,并在放疗后重复实验,验证其正确性。研究结果:1.miR-384在NSCLC细胞及组织中低表达,且能够影响NSCLC细胞的放疗敏感性:实验显示相较于正常肺上皮细胞系,miR-384在NSCLC细胞中表达降低。继而建立了miR-384敲除及过表达的稳定细胞系。进一步的克隆形成实验显示,敲除miR-384会显著提高NSCLC细胞的放疗耐受性,而过表达miR-384会导致放射增敏。2.ATM、Ku70、Ku80是miR-384的靶基因:通过软件预测发现,DNA损伤应答过程中的关键蛋白ATM、Ku70以及Ku80都是miR-384的潜在靶基因。荧光素酶报告试验的结果显示,过表达miR-384能够抑制离体环境中ATM、Ku70、Ku80的3’UTR荧光素酶活性;而抑制miR-384后会增强ATM、Ku70、Ku80的3’UTR活性,western blotting及RT-PCR实验结果也再次证实ATM、Ku70、Ku80为miR-384的靶基因。3.miR-384调控NSCLC细胞的DDR过程:免疫荧光实验显示,敲除miR-384的NSCLC细胞胞核中γ-H2AX及53BP1的foci更少,消失更快;而过表达miR-384的NSCLC细胞胞核中的foci更多,消失更慢。western blotting实验显示,敲除miR-384能够增强ATM蛋白的磷酸化,加速其下游蛋白CHK2等的激活,抑制细胞的凋亡;过表达miR-384则会减弱ATM的磷酸化,减慢下游蛋白的激活,促进细胞凋亡。流式细胞学实验也显示出,在接受6Gy射线照射后,敲除miR-384的NSCLC细胞的凋亡水平明显减少;过表达MiR-384的细胞则凋亡增加。4.NF-κB能够负性调控miR-384的表达:启动子分析显示,NF-κB可能为miR-384的调控因子。RT-PCR实验结果显示,在NSCLC细胞中激活NF-κB通路后,miR-384的表达出现了下调。染色质免疫共沉淀实验(ChIP)的结果进一步表明,在放疗后,转录因子NF-κB能够与miR-384的启动子靶位点结合,继而抑制miR-384的表达。结论:1.miR-384在NSCLC细胞中低表达。2.miR-384与NSCLC细胞的放疗敏感性呈正相关。3.miR-384可以靶向抑制DDR通路关键蛋白ATM、Ku70、Ku80的表达。4.在放射线的作用下,NF-κB能够抑制miR-384的表达,继而增强NSCLC细胞的DNA损伤应答能力,抑制细胞凋亡,引起放疗抵抗。