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第一部分载多柔比星与吲哚菁绿的多功能靶向脂质体FA-DOX-ICG-PFP@Lip的制备及性能研究目的制备载多柔比星（Doxorubicin,DOX）和吲哚菁绿（Indocyanine green,ICG）的多功能相变型脂质体造影剂（FA-DOX-ICG-PFP@Lip）,并对其基本理化性质、生物安全性、靶向能力、光热转换能力、相变能力、药物释放特性进行检测。方法1.采用薄膜水化-双步乳法制备FA-DOX-ICG-PFP@Lip多功能相变型脂质体造影剂。同时,在光学显微镜和透射电镜下观察其形态结构;通过马尔文粒径检测仪检测其粒径、电位;通过紫外分光光度计检测脂质体中DOX和ICG的含量并计算各自的包封率（Encapsulation efficiency,EE）和载药量（Loading content,LC）;通过激光共聚焦显微镜检测FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体表面的叶酸（Folic acid,FA）表达;将FA-DOX-ICG-PFP@Lip分散在磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline,PBS）中保存一周,检测其粒径变化。2.生物安全性:将不同浓度的未装载DOX的脂质体FA-ICGPFP@Lip（0.625,1.25,2.5,5 mg/m L）与细胞共孵育,然后用CCK-8法检测细胞的存活率。将健康小鼠随机分为空白对照组（经尾静脉注射200μL生理盐水）和FA-ICG-PFP@Lip组（经尾静脉注射200μLFAICG-PFP@Lip,2.5 mg/m L）,在给药1 d、7d、15d后处死小鼠并收集其血液样本行血常规和生化检查。3.靶向能力及体内分布:将FA修饰的FA-DOX-ICG-PFP@Lip和未修饰的DOX-ICG-PFP@Lip与叶酸受体（Folate recepter,FR）高表达的Y79视网膜母细胞瘤细胞和提前用FA封闭的Y79视网膜母细胞瘤细胞共孵育,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测脂质体的靶向能力。建立Y79荷瘤小鼠模型,通过尾静脉注射Di R标记的FADOX-ICG-PFP@Lip和DOX-ICG-PFP@Lip,在不同时间节点通过活体荧光成像仪监测荷瘤小鼠体内的荧光分布,采集相关图像并测量肿瘤部位的荧光信号强度。24 h后,处死小鼠并分离出肿瘤和主要脏器行组织荧光成像,对比肿瘤和不同器官的荧光信号强度。4.光热转换能力:用808 nm激光对不同浓度的FA-DOX-ICGPFP@Lip（0.625、1.25、2.5、5 mg/m L）辐照并用热成像仪监测其温度的变化,同时在光学显微镜下观察脂质体光致液滴相变（Optical droplet vaporization,ODV）的过程。在Y79荷瘤小鼠模型中尾静脉注射FADOX-ICG-PFP@Lip和DOX-ICG-PFP@Lip,用808 nm激光辐照荷瘤小鼠的肿瘤部位并用热成像仪监测温度变化并采集相应图像。5.药物释放特性:用808 nm激光对FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体（2.5 mg/m L）辐照,采集激光辐照前后不同时间点的样本并通过紫外分光光度计检测样本中DOX的累积释放量。结果1.采用薄膜水化-双乳法成功制备了FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体,其溶液呈灰绿色。透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）下观测到该脂质体呈现球状,尺寸均一且有良好的分散度。马尔文粒径仪测得FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体粒径为（309.5±16.7）nm,zeta电位约（-23.5±8.6）m V。测得DOX的包封率为（62.04±5.10）%,载药量为（5.17±0.43）%;ICG的包封率为（91.85±2.98）%,载药量为（7.56±0.25）%。通过激光共聚焦显微镜检测发现脂质体表面叶酸呈高表达状态。FA-DOX-ICG-PFP@Lip分散于PBS于4℃放置一周后,粒径轻微增加表明该脂质体具有较好的稳定性。2.生物安全性:FA-ICG-PFP@Lip脂质体与Y79视网膜母细胞瘤细胞和HUVECs人脐静脉内皮细胞共孵育后细胞存活率均在90%以上,健康小鼠注射脂质体后,一般情况及相关血液检查均未发现异常。3.靶向能力及体内分布:在激光共聚焦显微镜下观察到叶酸受体高表达的Y79细胞吞噬了大量FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体,而未被叶酸修饰的脂质体吞噬明显减少。不仅如此,当提前用游离叶酸拮抗Y79表面的叶酸受体后,Y79周围的FA-DOX-ICG-PFP@Lip明显减少。流式细胞仪检测也得到了一致的结果。荷瘤小鼠活体荧光成像显示注射FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体3 h后纳米粒在肿瘤部位积聚量达到最大。4.光热转换能力:对FA-DOX-ICG-PFP@Lip给予808 nm激光辐照后升温效果明显,且与脂质体浓度呈正相关关系。同时发现脂质体的光热稳定性较ICG溶液明显增加。光学显微镜下观察发现经808 nm激光辐照后脂质体能迅速相变成微泡。在体内光热转化能力检测实验中脂质体也展现出良好的光热转换效率。5.药物释放特性:通过紫外分光光度计分析发现脂质体经808 nm激光辐照后DOX的释放速率显著上升。结论通过薄膜水化-双步乳法成功制备了载DOX和ICG的相变型多功能脂质体FA-DOX-ICG-PFP@Lip,其大小均一、稳定性好、载药量高,同时制备的脂质体具有良好的生物安全性、靶向能力和光热转换能力,808 nm激光辐照可促进药物释放,为视网膜母细胞瘤的成像和治疗奠定了基础。第二部分载多柔比星与吲哚菁绿的多功能靶向脂质体FA-DOX-ICG-PFP@Lip双模态成像能力的研究目的探究FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体的光声和超声成像能力,为RB的诊断提供基础。方法通过光声成像仪和超声成像仪对6组样本[FA-DOX-ICG-PFP@Lip（0.625、1.25、2.5、5 mg/m L）、DOX-ICG-PFP@Lip（5 mg/m L）和生理盐水,n=5]进行体外光声成像和超声成像实验,采集相关图像并对其信号强度进行分析。此外将Y79荷瘤小鼠随机分为2组（n=5）:FADOX-ICG-PFP@Lip（2.5 mg/m L）和DOX-ICG-PFP@Lip（2.5 mg/m L）,经尾静脉注射脂质体后,于不同时间点通过光声成像仪和超声成像仪采集荷瘤小鼠肿瘤部位的光声和超声成像图,定量分析各组光声、超声信号强度。结果光声成像:体外实验中光声信号随FA-DOX-ICG-PFP@Lip浓度的增加而增强,相同浓度的FA-DOX-ICG-PFP@Lip和DOX-ICGPFP@Lip之间光声信号强度没有统计学差异（p＞0.05）,生理盐水组没有探测到光声信号。体内注射FA-DOX-ICG-PFP@Lip和DOX-ICGPFP@Lip脂质体1 h后,肿瘤部位开始出现较为明显的光声信号,随后逐渐增强于3 h到达峰值,然后信号逐渐衰减。超声成像:体外实验结果显示各组脂质体在808 nm激光辐照0-5 min的过程中回声信号逐渐增强,在4min时达到最大,且回声信号的强度与脂质体的浓度正相关,相同浓度的FA-DOX-ICG-PFP@Lip和DOX-ICG-PFP@Lip之间超声信号强度没有统计学差异（p＞0.05）,生理盐水组没有检测到回声信号。体内注射FA-DOX-ICG-PFP@Lip和DOX-ICG-PFP@Lip脂质体后,对肿瘤部位给予808 nm激光辐照,FA-DOX-ICG-PFP@Lip组荷瘤裸鼠其肿瘤部位的回声信号增强较DOX-ICG-PFP@Lip组更明显。结论FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体具有优良的光声和超声成像能力,为视网膜母细胞瘤的靶向显影提供了条件。第三部分近红外激光联合FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体对视网膜母细胞瘤治疗作用的研究目的评估近红外激光联合FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体对视网膜母细胞瘤化疗联合光热治疗的效果。方法通过CCK-8法检测7组样本（生理盐水对照组、激光组、DOX、FA-DOX-ICG-PFP@Lip、FA-ICG-PFP@Lip+激光、DOX-ICG-PFP@Lip+激光和FA-DOX-ICG-PFP@Lip+激光）作用于Y79后各组细胞的存活情况。将Y79荷瘤小鼠随机分为7组并给予不同的处理（n=5）:生理盐水对照组、激光组、DOX、FA-DOX-ICG-PFP@Lip、FA-ICGPFP@Lip+激光、DOX-ICG-PFP@Lip+激光和FA-DOX-ICG-PFP@Lip+激光,连续14 d观察荷瘤小鼠的体重和肿瘤体积。14 d后处死小鼠,收集肿瘤组织和主要脏器进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色,并通过TUNEL和PCNA技术检测各组癌细胞的凋亡和增殖。结果体外实验中DOX-ICG-PFP@Lip+激光和FA-DOX-ICG-PFP@Lip+激光处理Y79细胞后细胞的存活率最低,而单纯激光辐照对Y79细胞没有杀伤作用。体内治疗结果显示,FA-DOX-ICG-PFP@Lip+激光组肿瘤体积逐渐缩小,展现出了最佳的抑制肿瘤生长的疗效。肿瘤部位HE染色结果显示,FA-DOX-ICG-PFP@Lip+激光组存在明显的核溶解,可见大量细胞坏死。TUNEL和PCNA的结果显示FA-DOX-ICGPFP@Lip+激光组肿瘤细胞凋亡指数最高,增殖指数最低。结论近红外激光联合FA-DOX-ICG-PFP@Lip脂质体实现了双模态成像引导下化学/光热协同治疗视网膜母细胞瘤,有效地抑制了肿瘤的生长和复发。