“跨界基因沉默”技术是由向双林等首次提出的跨原核界和真核界的基因沉默技术。该技术构建了一种“跨界干扰质粒”(trans-kingdom RNAi plasmid,TRIP),TRIP 质粒主要包含了 inv 基因、hly基因以及能够转录shRNA的基因片段。inv基因表达的入侵蛋白(Invasin)可以帮助细菌穿过细胞膜进入真核细胞;hly基因表达的溶血蛋白(listeriolysinO,LLO)可以使细菌逃离真核细胞的吞噬体。转化了 TRIP质粒的大肠杆菌被称之为“跨界基因沉默菌株”。跨界基因沉默菌株能够顺利地进入真核细胞并且成功逃离真核细胞的吞噬体,最后在细胞质中释放转录的shRNA干扰片段,从而引起真核细胞的基因沉默。但是hly基因表达的LLO蛋白又是一种很强的毒力因子,它不仅能够帮助细菌逃离真核细胞的吞噬体同时它对宿主细胞又具有一定的伤害,所以我们在LLO蛋白上构建多种点突变,并且筛选出具有减毒效果的突变型跨界基因沉默菌株。通过重叠 PCR 我们]构建了 K50A、R149A、D157A、K220A、R378A、Y427A、N432A这七种点突变质粒,加上实验室本来存在的APEST与G486D两种突变质粒一共是九种突变质粒。将这九种突变型质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中获得了九种“突变型跨界基因沉默菌株”。在本实验中,我们首先利用菌液PCR检测了这九种突变型跨界基因沉默菌株中含有hly和inv基因,从而证明了这些菌株为阳性的、正确的突变型跨界基因沉默菌株。然后,我们进行了 Western blotting实验和细菌侵染细胞实验,两种实验结果表明了九种突变型跨界基因沉默菌株仍有LLO蛋白的正常表达以及这些菌株也能够成功地进入真核细胞。因LLO蛋白具有溶血功能,所以我们利用血平板实验、体外溶血实验以及MTT实验最终筛选出具有减毒效果的突变型跨界基因沉默菌株。血平板实验进行初筛,它的结果显示九种突变型跨界基因沉默菌株和TRIP阳性菌株一样具有溶血活性,但形成的β溶血环大小差异却不十分明显,所以九种突变型跨界基因沉默菌株都进行下一步的体外溶血实验进行筛选。通过体外溶血实验,我们初步筛选出了溶血活性明显低于TRIP阳性菌株并且具有减毒效果的四种突变型跨界基因沉默菌株(p<0.05)。最后MTT实验结果也显示D157A、K220A、R378A、G486D这四种突变型菌株仍然具有减毒效果,且R378A、G486D这两种突变型跨界基因沉默菌株与TRIP阳性菌株的差异具有极显著性(p<0.01),所以我们推测R378A和G486D这两种突变型跨界基因沉默菌株减毒效果最佳。减毒后的突变型跨界基因沉默菌株将更好地发挥RNAi作用,并且推进工程菌的研发和利用。