【摘 要】
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石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)属于麻痹性贝类中毒中最常见且具有高毒性的一种毒素。摄入量不同症状存在差异,轻则恶心、呕吐;中则肌肉麻痹、心律失常;重则数分钟内死亡。国标检测方法中小鼠生物法存在伦理、个体差异等问题;液相色谱及液相色谱-串联质谱法需要专业技术人员操作且前处理过程复杂;酶联免疫吸附法存在交叉反应,抗体制备困难等不足。因此,很有必要建立一种简单、灵敏、实用型的石房蛤毒素检测方法。
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石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)属于麻痹性贝类中毒中最常见且具有高毒性的一种毒素。摄入量不同症状存在差异,轻则恶心、呕吐;中则肌肉麻痹、心律失常;重则数分钟内死亡。国标检测方法中小鼠生物法存在伦理、个体差异等问题;液相色谱及液相色谱-串联质谱法需要专业技术人员操作且前处理过程复杂;酶联免疫吸附法存在交叉反应,抗体制备困难等不足。因此,很有必要建立一种简单、灵敏、实用型的石房蛤毒素检测方法。研究采用分子模拟技术建立STX特异性多肽库并进行优化筛选,同时应用电化学方法对特异性多肽进行确认。从Protein Data Bank(PDB)库获取含STX结构的蛋白复合物晶体结构ID,通过分子对接查看相互作用能打分以及受配体2D作用图截取亲本多肽片段S0。进行基于稳定性的虚拟氨基酸定点突变和饱和突变,对突变能评估结果进行随机排列组合,插入或突变氨基酸为半胱氨酸以满足后期实验修饰条件,构建特异性多肽库。选择不同原则下九条多肽链(含最值)进行定点突变及分子动力学优化,选取最后一帧构象依次与STX进行分子对接,依据能量打分值初筛出六条(S1、S2、S3、S4、S5、S6)多肽链进行后续电化学传感器的构建。采用循环伏安法和电化学交流阻抗法分别从电流、电阻角度研究六条多肽链与STX的特异性结合能力,结果均显示S4识别STX能力最强,故确定S4作为识别元件进行检测方法的建立。基于S4构建检测STX的电化学多肽传感器方法研究。在玻碳电极表面电聚合还原氧化石墨烯和金纳米粒子来放大响应信号及增加电极表面负载,通过实验条件优化确定,在复合材料电聚合扫描圈数为10圈、多肽浓度为0.5μg/m L、多肽孵育时间为90 min、巯基己醇封闭时间为50 min、目标物孵育时间为90 min的条件下,目标物分子在10-2~1μg/L的浓度范围内具有良好的线性关系(R~2=0.9993),方法的检出限(S/N=3)为6.9×10-4μg/L。实际样品加标回收实验得出回收率在87.3~116.2%范围内,同时方法验证实验表明该方法具有良好的选择性、重现性、稳定性。基于特异性多肽S4的电化学传感器方法具有实际可行性,可用于STX的快捷、灵敏、痕量检测。
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