焦虑是一种由预期的或者潜在的威胁引发的情绪行为,是人类情感经历的正常组成部分,但过度的或者不适当的焦虑则是一种疾病,即焦虑性神经症,临床表现为没有事实根据也无明确客观对象和具体观念内容的惊恐不安。流行病学研究显示大约29%的人群在一生中的某段时间会遭受严重的焦虑困扰。然而,关于焦虑症的病理生理过程以及焦虑相关行为的分子机制研究还比较薄弱。临床上广泛采用的抗焦虑药物是BZDs（benzodiazepines,苯二氮卓类）药物和 SSRIs（Selective serotonin reuptake inhibitors,5-羟色胺再摄取抑制剂）类药物。BZDs由于其严重的嗜睡、成瘾性、耐受性等副作用,而被SSRIs类药物取代成为二线治疗药物。不幸的是,目前治疗焦虑症的一线药物—SSRIs,发挥疗效需要3-4周,具有明显的临床延迟效应。故深入研究焦虑症的发病机制,寻找新作用机制的抗焦虑药物尤为必要。海马作为大脑边缘系统重要结构之一,其在情感障碍类疾病的发病和治疗中所起的作用备受关注。nNOS（neuronal nitric oxide synthase,神经元型一氧化氮合酶）是中枢神经系统中一种主要的NO（nitric oxide,一氧化氮）合酶,在边缘系统中表达丰富。我们实验室研究发现海马nNOS高表达是应激及糖皮质激素导致HPA（hypothalamic-pituitary-adrenal,下丘脑—垂体—肾上腺）轴亢进的分子机制。还发现海马nNOS是突触后5-HT1A受体调控焦虑行为的关键效应分子。CAPON作为nNOS N-端PDZ结构域的转接蛋白,迄今已发现至少2种异构体,一种是503个氨基酸残基的CAPON-L,另一种是211个氨基酸残基的CAPON-S。CAPON-L的N-端有磷酸酪氨酸结合域（PTB）,而CAPON-S缺乏PTB结合域,对树突的发生、生长和维持起到调控作用。研究发现CAPON基因的多态性和精神分裂症、双向情感障碍以及PTSD（posttraumatic stress disorder,创伤后应激综合症）的发病具有高度相关性,并且此类疾病患者的CAPON基因没有发生突变而表达却明显增加。早先,我们实验室证明nNOS通过调控海马神经细胞新生介导抑郁行为。此外,nNOS对突触发育和病理情况下的突触丢失均有重要的作用,而CAPON与突触的建立也密切相关。另外,nNOS与CAPON耦联形成nNOS-CAPON-突触素三元复合物,使得nNOS能够定位于突触前的突触部位。综上所述,nNOS-CAPON相互作用可能在调节焦虑行为中起重要作用。并且nNOS-CAPON相互作用可能通过影响突触结构可塑性参与焦虑行为的调节。如果是这样的话,有可能发现抗焦虑的新靶点。为证明此推测,本课题设计了三部分研究内容:1)研究nNOS-CAPON耦联在焦虑行为调节中的作用及意义,以发现抗焦虑的新靶点;2)基于该新靶点,寻找全新的抗焦虑药物;3)探讨nNOS-CAPON耦联发挥抗焦虑作用的分子机制。在第一部分研究中,我们使用慢病毒包装全长CAPON-L（LV-CAPON-L-GFP）,通过立体定位转染小鼠双侧海马,在海马内过表达CAPON-L。结果发现,海马内nNOS-CAPON耦联显著增加,小鼠出现典型的焦虑样行为学表型,而nNOS-/-小鼠未表现出焦虑样行为变化。为了进一步确证nNOS-CAPON耦联在焦虑行为调节中所起的作用,我们将慢病毒包装的CAPON-C-端20个氨基酸（LV-GFP-CAPON-20C）和 CAPON-C-端 125 个氨基酸（LV-CAPON-125C-GFP）以及运用基因工程方法合成的CAPON-L-C末端12个氨基酸的小肽（Tat-CAPON-12C）,立体定位注射到小鼠双侧海马。结果发现,海马内nNOS-CAPON耦联显著减少,并表现出明显的抗焦虑样作用,而此抗焦虑样作用在nNOS基因敲除动物上消失。继而,我们进一步探讨了海马nNOS-CAPON耦联在应激诱导的焦虑行为中的作用。我们应用慢性温和应激（CMS）模型诱导小鼠焦虑行为,发现CMS明显增加小鼠海马nNOS和CAPON-L的表达及二者的耦联,并且海马内转染LV-CAPON-125C-GFP阻断nNOS-CAPON耦联能逆转CMS所致的焦虑行为,此外,在体外培养的原代神经元上用皮质酮（CORT）模拟动物应激模型,也能显著增加nNOS-CAPON耦联。这些结果表明海马内nNOS-CAPON耦联介导了应激所致的焦虑行为。我们还探讨了应激导致nNOS-CAPON耦联的分子机制。初步结果显示应激诱导的海马nNOS过表达,产生过量的NO,继而刺激了CAPON-L的表达,导致nNOS-CAPON相互作用增强。上述结果证明nNOS-CAPON耦联可作为抗焦虑的新靶点。为了发现基于该新靶点的小分子抗焦虑药物,我们在第二部分研究中分析了 nNOS与CAPON相互作用的化学及分子力学机制,设计了系列小分子化合物,在体外培养的原代神经元上检测其对nNOS-CAPON耦联的影响,发现ZLc-002阻断nNOS-CAPON耦联最为明显。于是深入研究ZLc-002对焦虑行为的影响。结果发现腹腔注射ZLc-002（40mmg/kg,80mg/kg）和尾静脉注射 ZLC-002（10mg/kg,20mg/kg,40mg/kg）均明显减少海马nNOS-CAPON耦联,并具有显著的抗焦虑样作用,而此抗焦虑样作用短至给药后24小时即可显现。为了研究ZLc-002是否通过阻断海马nNOS-CAPON耦联发挥抗焦虑样作用,我们通过立体定位将ZLc-002注射到小鼠双侧海马,观察到海马nNOS-CAPON耦联降低,小鼠表现出明显的抗焦虑样作用,而这一作用在nNOS基因敲除小鼠上消失。此外通过药物代谢动力学研究发现,ZLC-002作为一个前药,进入体循环后转变成ZLc-002-1,继而透过血脑屏障阻断海马nNOS-CAPON耦联发挥抗焦虑样作用。最后,我们还对ZLC-系列小分子化合物进行了构效关系分析,发现阻断nNOS-CAPON耦联的强度与化合物抗焦虑样作用的效能密切相关,提示化合物的活性与其结构之间具有一定的相关性。第三部分,我们初步探讨了阻断nNOS-CAPON耦联发挥抗焦虑作用的可能机制。首先,我们通过干预nNOS-CAPON耦联,检测对突触发生相关蛋白突触素（Synapsin）和棘蛋白（Spinophilin）表达的影响。研究发现在体外培养的原代神经元上,促进nNOS-CAPON耦联显著降低synapsin和spinophilin的水平。相反,阻断nNOS-CAPON耦联则明显增加synapsin和spinophilin的表达。而在整体动物上调节nNOS-CAPON耦联得到了以上相似的结果。另外,阻断nNOS-CAPON耦联增加神经元树突分枝。虽然有大量研究发现PSD-95与突触结构可塑性及焦虑症密切相关,但是我们研究发现nNOS-CAPON耦联不影响PSD-95的表达及其与其他相关蛋白的耦联。所以,nNOS-CAPON耦联调节焦虑行为不涉及到PSD-95的表达水平及功能。我们还发现ZLc-002发挥抗焦虑作用所需时间远远短于5-HT1A受体激动剂和5-HT再摄取抑制剂,因此阻断nNOS-CAPON耦联的化合物不可能是5-HT1A受体激动剂或者5-HT再摄取抑制剂。最后,通过电生理方法证明了阻断nNOS-CAPON耦联不影响GABA诱发的抑制性突触后电流,并且ZLc-002发挥抗焦虑作用的同时不具有BZDs的镇静、肌肉松弛、运动失调等副作用,故阻断nNOS-CAPON耦联不通过调节GABA功能发挥抗焦虑作用。综上所述,nNOS-CAPON耦联靶点是抗焦虑新靶点;ZLC-002是全新的抗焦虑药物,起效快且不具有严重的副作用;nNOS-CAPON耦联发挥抗焦虑作用可能是通过影响了突触结构可塑性实现的。