病毒是严格的细胞内寄生物，在病毒感染细胞的过程中，为了利用细胞资源进行有效复制，病毒常常进化出各种策略调控细胞的生理代谢，如抑制细胞蛋白翻译、调控细胞自噬等。猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种严重危害全球养猪业的重要病毒性传染病。自上世纪八十年代后期被发现以来，PRRS病毒(PRRSV)几乎遍布世界主要养猪国家，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV具有高度变异的特性和免疫抑制能力，以前的研究主要关注其遗传变异规律与免疫抑制机制，对PRRSV感染后细胞的生理代谢变化及其生物学意义的研究相对较少。目前，关于PRRSV感染是否抑制宿主细胞蛋白翻译尚未见报道，其调控细胞自噬的类型和作用机制也没有定论。本研究首先从病毒感染水平证实PRRSV感染抑制细胞的蛋白翻译，并发现PRRSV的非结构蛋白nsp2和nsp5是其抑制宿主蛋白翻译的主要病毒编码蛋白。进一步探讨了nsp2抑制宿主蛋白翻译的分子机制，同时深入分析了nsp5调控细胞自噬的机制。主要研究内容如下：
　　1.PRRSV感染抑制细胞的翻译水平
　　利用嘌呤霉素能指示细胞翻译水平的原理，采用间接免疫荧光实验检测PRRSV感染对细胞蛋白翻译的影响，发现PRRSV感染后细胞的翻译水平明显降低。Westernblot检测进一步证实PRRSV感染MARC-145细胞24h后即能明显抑制宿主细胞的翻译水平，且随着感染时间的延长抑制作用越来越明显。用PRRSV感染原代的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后也观察到同样的现象，但紫外线灭活的PRRSV不影响细胞的翻译水平，表明PRRSV抑制细胞蛋白翻译依赖于病毒复制。
　　为了确定PRRSV编码的哪种或哪几种蛋白参与抑制宿主细胞蛋白翻译，将PRRSVWUH3株编码的所有非结构蛋白的真核表达质粒分别转染Hela细胞，通过间接免疫荧光实验发现非结构蛋白nsp2和nsp5能够明显抑制细胞蛋白翻译。同时，采用Westernblot方法检测了所有非结构蛋白对HEK293T细胞翻译水平的影响，检测结果进一步证实nsp2和nsp5具有抑制宿主细胞蛋白翻译的特性。因此，我们分别以nsp2和nsp5为对象开展了后续研究。
　　2.PRRSVnsp2抑制宿主细胞翻译的分子机制
　　为了阐明PRRSVnsp2抑制细胞蛋白翻译的机制，我们构建了nsp2的3个截短突变体(N端木瓜样蛋白酶结构域(PL2)、中间高变区(HV)和C端跨膜区(TM))的真核表达质粒，转染细胞后，通过Westernblot和间接免疫荧光实验检测发现，PRRSVnsp2及其TM结构域能够抑制细胞蛋白翻译，并且nsp2对翻译的抑制作用依赖其线粒体定位。荧光显微镜观察结果证实过表达nsp2及其TM结构域显著抑制EGFP的表达，但荧光定量PCR实验结果显示EGFP的转录水平没有受到明显影响，表明nsp2及其TM结构域特异性抑制宿主细胞的翻译。
　　eIF2α磷酸化是细胞翻译调控过程中的一种关键修饰。我们分析了nsp2及其TM结构域对细胞eIF2α磷酸化的影响，发现nsp2及其TM结构域均不影响eIF2α的磷酸化水平，表明nsp2及其TM结构域抑制细胞蛋白翻译不依赖于eIF2α的磷酸化，同时也提示PRRSV可能存在不依赖eIF2α磷酸化的抑制翻译的机制。为了从病毒水平上进一步证实这一推测，利用可以消除eIF2α磷酸化诱导的宿主翻译关闭的药物ISRIB处理PRRSV感染后的细胞，Westernblot检测发现PRRSV抑制的细胞蛋白翻译水平仅有部分恢复，表明PRRSV通过诱导eIF2α磷酸化抑制细胞翻译的作用有限，PRRSV抑制翻译还存在不依赖eIF2α磷酸化的其它机制。
　　为了进一步确定PRRSV是否通过mTOR通路抑制细胞蛋白翻译，通过Westernblot检测PPRSV感染对mTOR通路主要信号分子磷酸化水平的影响，发现PRRSV感染显著抑制mTOR、4E-BP1、S6K和eIF4E的磷酸化，并且mTOR通路的激活剂能够恢复PRRSV所抑制的细胞蛋白翻译水平，表明PRRSV感染可通过抑制mTOR通路进而抑制细胞蛋白翻译。进一步检测了PRRSVnsp2及其突变体对mTOR通路的影响，证实nsp2及其TM结构域的表达均显著抑制mTOR通路激活。
　　综合PRRSV感染细胞和nsp2及其突变体过表达对宿主细胞蛋白翻译影响的研究结果，证实PRRSV抑制细胞蛋白翻译至少存在两种途径，即诱导eIF2α磷酸化和抑制mTOR信号通路。其中，nsp2主要参与mTOR信号通路的抑制过程。
　　3.PRRSVnsp5诱导不完全自噬的分子机制
　　以前的研究报道PRRSVnsp5、nsp6、nsp7融合表达蛋白(nsp567)能诱导自噬，而我们的研究发现nsp5具有抑制宿主细胞蛋白翻译的特性。因此，推测nsp5可能通过诱导自噬，从而影响细胞蛋白翻译。基于此，我们分别构建了表达PRRSVnsp5、nsp56、nsp67、nsp7和nsp567的真核表达质粒，并转染HEK293T细胞。通过Westernblot检测发现，nsp5、nsp56和nsp567均能上调LC3-II的表达水平，间接免疫荧光实验也证实nsp5、nsp56和nsp567诱导GFP-LC3的点状聚集，而nsp67和nsp7不具备这种特性，说明nsp5能诱导自噬体累积。
　　自噬体累积可通过诱导自噬体产生和抑制自噬体降解两种途径实现。为了探讨nsp5通过哪种途径诱导自噬体累积，首先将nsp5的真核表达质粒转染HEK293T细胞，然后利用氯喹处理细胞，阻断自噬体的降解途径。Westernblot检测发现LC3-II的表达水平没有上调，表明nsp5并不诱导自噬体产生。进一步分析了nsp5对自噬体降解的影响，发现过表达nsp5的细胞中自噬体和溶酶体不存在共定位，表明nsp5抑制了自噬体降解。在PRRSV感染的细胞中，也同样观察到PRRSV诱导的自噬体累积是由于自噬体降解被阻断导致的。
　　有文献证实，细胞的SNARE蛋白(SNAP29、STX17、VAMP8)的相互作用直接介导自噬体和溶酶体融合。为了阐明nsp5是否影响这三个SNARE蛋白之间的相互作用，通过免疫共沉淀(Co-IP)和间接免疫荧光实验分析，发现过表达nsp5抑制STX17和SNAP29的相互作用，但是对VAMP8和SNAP29的相互作用没有显著影响。进一步的分析发现，nsp5与STX17的N端结构域和SNARE结构域均存在相互作用。由于SNARE结构域介导SNARE蛋白之间的相互作用，因此，nsp5与STX17的SNARE结构域相互作用可能抑制了STX17与SNAP29的相互作用，从而抑制了自噬体和溶酶体融合，这可能是PRRSV诱导不完全自噬的机制之一。
　　总之，本研究证实PRRSV通过编码nsp2蛋白抑制mTOR信号通路进而诱导宿主细胞蛋白翻译关闭，通过编码nsp5蛋白抑制STX17与SNAP29互作进而抑制自噬体和溶酶体融合。本研究为更深入地了解PRRSV感染对细胞生理代谢的影响及其生物学意义奠定了基础。