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非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)以其高发率及危害性得到了广泛关注,直到现在,其发病机制仍未完全阐明。众多研究显示遗传易感性和胰岛素抵抗可能与NASH的发生与发展关系紧密。NASH的一个很重要的危害就是其向肝纤维化发展的不可逆性,肝脏纤维化是由于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成过多,同时未能及时降解导致其积聚,从而影响正常的肝脏结构和功能。ECM是由肝星状细胞(hepatic satellite cell,HSC)合成分泌的,当各种刺激诱导HSC使其活化为肌成纤维细胞,产生大量的ECM,成为肝脏纤维化的基础,HSC是研究NASH进展至关重要的靶细细。研究发现NASH患者肝组织标本肝细胞凋亡明显增多,并且随肝纤维化和肝炎炎症病变程度的增加而增加,因此,肝细胞的凋亡与NASH关系密切。核转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)作为细胞防御氧化应激的重要调节因子,主要是通过抵御内、外源性的氧化应激来保护细胞。Nrf2在NASH中的保护作用明确,但具体机制尚未完全阐明。p66Shc在细胞氧化应激及凋亡过程中发挥重要作用。研究显示,敲除p66Shc可增强小鼠的抗氧化能力,且延长其寿命。p66Shc在心脏、肝脏、脾脏、肺脏中表达程度不同,在动物脂肪组织中表达较高,可能与调节细胞内脂质蓄积和脂肪组织的形成有关。脂质过氧化引起的氧化应激是导致NASH纤维化的重要因素,抗氧化治疗有助于延缓肝内炎症及纤维化的发展。IQGAP1是一种Ras GTP酶活化蛋白,在细胞骨架形成和粘附中起重要作用。最新研究显示IQGAP1可能是Nrf2的伴侣分子,在保持Nrf2的稳定性过程中发挥重要作用。当上调IQGAP1表达会增加Nrf2的抗氧化效应,提高抗氧化基因的表达,下调IQGAP1的表达则可降低Nrf2的稳定性和II相酶的表达,导致抗氧化能力的减弱。目的我们在前期研究证实Nrf2在NASH的进展中起保护作用的基础上,采用慢病毒转染技术,构建上调和下调Nrf2的稳转大鼠肝星状细胞株和肝细胞株,应用葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GO)构建细胞氧化应激模型,观察调控Nrf2表达对两种细胞抗氧化能力的影响,并进一步探讨调控Nrf2表达对p66Shc和IQGAP1蛋白表达的影响,为完善Nrf2在NASH中的保护机制及治疗该病提供新的研究方向。方法1.针对大鼠Nrf2基因4个干扰位点,设计并构建4种Nrf2基因sh RNA慢病毒重组质粒载体;利用PCR技术从含有rat Nrf2的质粒模板中克隆目的基因,构建含Nrf2的慢病毒表达质粒载体。进行慢病毒载体的包装、测序鉴定及滴度测定,分别转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6和肝细胞株BRL-3A细胞,用real time PCR(RT-PCR)和Western blot技术检测转染96h后的细胞的Nrf2表达水平,确定转染成功后,用致死量浓度药物嘌呤霉素(2.5ug/ml)处理细胞,筛选并构建稳定表达的细胞株。2.将稳转的HSC-T6和BRL-3A分为对照组和氧化应激组,每个组含5个亚组,以HSC-T6为例,分别为HSC-T6(空白对照组)、HSC-T6-sh RNA-NC(下调Nrf2阴性对照组)、HSC-T6-sh RNA(下调Nrf2组)、HSC-T6-Nrf2-NC(上调Nrf2阴性对照组)和HSC-T6-Nrf2(上调Nrf2组)。对照组常规培养;氧化应激组:加入含100U/L GO的细胞培养基培养2h,制备氧化应激模型。流式细胞仪检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量,用酶标仪来检测细胞生存率及丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(Lactic Acid Dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)的表达水平。3.分别提取实验2中对照组和氧化应激组的细胞总蛋白,Western blot检测p66Shc和IQGAP1蛋白表达情况。结果1.测序证实Nrf2的sh RNA及表达质粒的成功构建。HSC-T6和BRL-3A转染重组慢病毒载体后常规培养96 h,RT-PCR和Western blot证实重组慢病毒载体能在m RNA和蛋白水平有效下调/上调靶细胞中Nrf2基因的表达。用致死量浓度药物嘌呤霉素处理转染细胞后,再次RT-PCR和Western blot证实Nrf2基因的表达在m RNA和蛋白水平均被抑制/促进。我们成功构建下调/上调Nrf2表达的稳定表达HSC-T6和BRL-3A细胞株。2.对于HSC-T6,对照组各指标(ROS、MDA、LDH、生存率和SOD)无显著性差异(P>0.05);而氧化应激刺激组ROS、MDA、LDH水平较对照组显著升高(P<0.05),生存率和SOD水平降低(P<0.05)。在氧化应激组中,上调Nrf2组的ROS、MDA、LDH水平较空白及其各自阴性对照组均下降(P<0.05),生存率和SOD水平升高(P<0.05);下调Nrf2亚组则得到相反的结果(P<0.05)。在BRL-3A中也得到相同结论。3.对于HSC-T6,上调Nrf2组后,较空白及其各自阴性对照组,p66Shc蛋白表达水平下降(P<0.05),IQGAP1蛋白表达水平升高(P<0.05);下调Nrf2组结果相反(P<0.05)。氧化应激组中,与对照组比较,p66Shc和IQGAP1蛋白表达量均升高,上调Nrf2组。较空白及其各自阴性对照组,p66Shc表达水平显著下降(P<0.05),IQGAP1表达水平显著升高(P<0.05);下调Nrf2组结果相反(P<0.05)。在BRL-3A中也得到相同结论。结论本实验成功构建Nrf2基因沉默和过表达的稳转HSC-T6和BRL-3A细胞株。Nrf2在两种细胞株中都具有抗氧化应激作用,且这种保护作用可能与p66Shc和IQGAP1的表达密切相关。