研究背景及目的阿尔兹海默病(Alzheimer’ s disease,AD)是一种以进行性记忆和认知功能衰退,同时伴有行为和人格改变为主要特征的神经系统退行性疾病。流行病学调查结果显示,在60岁以上人群中有10%的人饱受AD的困扰,而在85岁以上人群中AD的发病比例则高达50%。疾病不仅影响患者的身体和心理健康,而且对他们的照顾者、家庭和整个社会都造成了沉重的负担,因此AD已经成为一项亟待解决的全球公共卫生问题。但到目前为止,还没有能明确治愈这种疾病的方法。由β淀粉样蛋白(Aβ)构成的细胞外的淀粉样蛋白沉积是AD主要的神经病理学特征之一。遗传、生物化学和动物模型的数据均表明,Aβ在AD的发病中起着核心作用,在很长一段时间内都被认为是治疗AD的最有前景的目标。因此,进一步研究A β神经毒性的作用机制对于了解AD的发病机制并开发有效的治疗措施显得尤为重要。线粒体是一种由线粒体外膜和线粒体内膜包被的具有独特结构的细胞器。大量研究证实了线粒体在很多年龄相关性疾病中发挥着重要作用,AD作为一种复杂的多因素疾病,线粒体功能障碍也是其常见的病理改变。当线粒体中大量错误或未折叠蛋白累积时,就会激活线粒体未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPRmt)。UPRmt是一种线粒体与细胞核的信号转导途径,在应激状态下诱导线粒体保护基因(包括线粒体分子伴侣和蛋白酶)的激活,以重建线粒体的蛋白稳态。在线粒体基质和膜间隙内就分别有特定的分子伴侣协助维持高效的线粒体蛋白的折叠和组装。Hsp60伴侣蛋白位于线粒体基质中,主要促进相对较小的可溶性单体蛋白大的折叠。除了分子伴侣外,线粒体还含有几种质量控制蛋白酶用来识别和降解错误折叠或组装的蛋白质,其中CLPP和LONP1都是定位在线粒体基质中的ATP酶,主要负责降解错误折叠的蛋白质。在线粒体膜间隙中的蛋白酶HtrA2/Omi也具有识别和降解错误折叠蛋白的功能。UPRmt的激活已经被证实参与多种疾病的病理过程,有研究发现,无论家族性或散发性AD患者尸检的额叶皮层样本中都存在UPRmt相关基因的表达上调。在AD小鼠和C,.elegans模型中也有关于UPRmt被激活的报道。但在AD细胞模型中仍没有UPRmt的相关研究,且现有关于UPRmt在AD中的研究仍较少,其具体变化仍不明确。在哺乳动物中,甲羟戊酸信号途径负责催化对细胞代谢、生长和分化中起重要作用的代谢物的合成,为维持细胞的正常功能起重要作用。越来越多的研究表明线粒体和甲羟戊酸代谢通路之间存在密切的交互作用,其中UPRmt就能在应激状态下影响甲羟戊酸通路的代谢过程。在C.elegans模型中,甲羟戊酸途径代谢通路被认为是激活UPRmt的必要条件。但在哺乳动物细胞中,尤其在AD细胞模型中,目前还没有UPRmt与甲羟戊酸途径相互作用的研究。神经酰胺作为重要的第二信使,能够通过激活信号级联反应和促进自由基的生成来调控细胞生长、分化和凋亡等多种生物过程。很多证据显示神经酰胺与Aβ之间有直接或间接的联系,无论是在Aβ处理的神经元中还是AD患者脑组织中神经酰胺水平都有所升高。但是关于神经酰胺通路与UPRmt的相互作用研究仍较少。只有在C.elegasn模型中,神经酰胺信号通路被认为是激活UPRmt的必要条件。但在哺乳动物细胞中,尤其在AD细胞模型中,目前还没有UPRmt与神经酰胺通路相互作用的研究。因此,在本项研究中,我们通过检测在A β 25-35处理后的SHSY5Y细胞和APP/PS1转基因小鼠中UPRmt相关蛋白的水平来观察UPRmt在AD发病中的作用。并通过小干扰RNA(siRNA)和化学试剂来干扰甲羟戊酸或神经酰胺信号通路,以观察这两条通路在A β所诱导的SHSY5Y细胞的UPRmt反应中的作用。我们又利用HEK293和20E2细胞来观察内源性过表达APPsw对UPRmt的影响及甲羟戊酸途径在UPRmt中的作用。研究方法1.培养SHSY5Y细胞,并给于不同浓度的预先老化的A β 25-35,处理24小时后收集蛋白并Western blot检测UPRmt相关蛋白的表达;培养SHSY5Y细胞,给与20uM预先老化的Aβ 25-35处理4h后收集蛋白并Western blot检测UPRmt相关蛋白的表达;取3、9月龄C57对照鼠及APP/PS1转基因小鼠的海马组织,提取蛋白并Western blot检测UPRmt相关蛋白的表达。2.经20uM A β 25-35干预细胞4h后,检测细胞内甲羟戊酸通路中的酶HMGCS-1的表达变化;在无A β干预的情况下,分别给与对照组siRNA和两种序列的HMGCS-1 siRNA 干扰 SHSY5Y 细胞,48h 后收蛋白并 Western blot 检测 UPRmt 相关蛋白的表达;在对照组siRNA和两种序列的HMGCS-1 siRNA干扰SHSY5Y细胞48h后,每组再给与20uM A β 25-35处理4h,收集蛋白并Western blot检测UPRmt相关蛋白的变化。分别给与不同浓度及不同时间的simvastatin干预SHSHY5Y细胞,并在收集细胞前给与20uM A β 25-35处理4h。收集细胞,Western blot检测UPRmt相关蛋白的变化;镜下观察各组间细胞形态变化;透射电镜观察各组细胞中线粒体形态的变化;荧光和定量检测ROS水平变化;CCK8检测细胞活性。3.经20uM A β 25-35干预细胞4h后,检测细胞内神经酰胺通路中的酶SPTLC-1的表达变化;在无A β干预的情况下,分别给与对照组siRNA和两种序列的SPTLC-1 siRNA 干扰 SHSY5Y 细胞,48h 后收蛋白并 Western blot 检测UPRmt 相关蛋白的表达。在对照组siRNA和两种序列的SPTLC-1 siRNA干扰SHSY5Y细胞48h后,每组再给与20uM A β 25-35处理4h。收集细胞,Western blot检测UPRmt相关蛋白的变化;透射电镜观察各组细胞中线粒体形态的变化;荧光和定量检测ROS水平变化;CCK8检测细胞活性。4.培养HEK293和20E2细胞,Western blot检测两组细胞中UPRmt相关蛋白及HMGCS-1的表达;转染对照组或HMGCS-1shRNA 48h后,Western blot分别检测HEK293和20E2细胞内HMGCS-1和UPRmt相关蛋白的表达;转染对照组或HMGCS-1 shRNA 48h后,再给与100uM甲羟戊酸盐或等量的灭菌水干预4h,收集细胞Western blot检测20E2细胞中HMGCS-1及UPRmt相关蛋白的表达。研究结果1.在Aβ处理的SHSY5Y细胞中和APP/PS1小鼠中均出现UPRmt相关分子的表达上调1.1用预先老化的A β 25-35处理细胞SHSY5Y,A β浓度依次为2.5、5、10、20uM,24h后提蛋白检测显示:与对照组相比,经2.5、5、10、20uMA β干预后Hsp60、CLPP蛋白表达明显增加;与对照组相比,经2.5、10、20uMAβ干预后HtrA2/Omi蛋白表达增加;经10、20uM Aβ处理24h后LONP1蛋白的表达增加。外源性给与 20uM A β 25-35 处理 4h 后,SHSY5Y 细胞 LONP1、HSP60、HtrA2/Omi、CLPP蛋白表达增加。表明,外源性给与不同浓度A β干预不同时间后细胞内UPRmt相关蛋白表达增加,A β能够激活细胞内UPRmt反应。1.2与同月龄的对照组小鼠相比,3月龄的转基因小鼠Hsp60、HtrA2/Omi、CLPP蛋白表达增加,9月龄组转基因小鼠Hsp60、LONP1蛋白表达增加而HtrA2/Omi、CLPP蛋白表达无统计学差异。表明在AD小鼠模型中也存在UPRmt的激活。2.通过HMGCS-1 siRNA或simvastatin阻断甲羟戊酸信号途径抑制A β诱导的SHSY5Y细胞的UPRmt反应,且加剧了Aβ的细胞毒性作用有文献报道线虫中甲羟戊酸信号通路为激活UPRMT程序的必要条件。为研究其是否参与AD细胞模型中UPRmt反应的激活,我们分别应用HMGCS-1 siRNA和simvastatin来阻断甲羟戊酸通路。2.1首先检测到经20uM A β 25-35干预4h后,SHSY5Y细胞内HMGCS-1蛋白表达增加。与转染对照组siRNA相比,转染HMGCS-lsiRNA 48h后细胞内HMGCS-1蛋白水平明显下降。在没有A β干预的条件下,UPRmt相关蛋白在转染对照组和HMGCS-1小干扰组细胞内的表达没有明显的统计学差异。我们还发现转染不同序列 HMGCS-1 siRNA 后,A β 干预的 SHSY5Y 细胞内 UPRmt 相关蛋白 HSP60、LONP1、HtrA2/Omi、CLPP表达较对照转染组下降。2.2分别给与luM和10uM simvastatin处理细胞2、6、24小时,收集蛋白前每组再给与 20uM A β 25-35 处理 4h。Western blot 结果显示,除 luM simvastatin处理细胞24h组外,其余各组UPRmt相关蛋白HSP60、LONP1、HtrA2/Omi、CLPP表达较对照组均下降。因此,通过HMGCS-1siRNA或simvastatin抑制甲羟戊酸信号通路均可以降低由Aβ引起的UPRmt反应。2.3为进一步研究抑制甲羟戊酸信号通路对细胞的影响,我们又检测了simvastatin预处理后细胞形态、线粒体形态,细胞内ROS水平及细胞活性改变。结果显示经过10uM simvastatin预处理细胞24后,细胞形态明显改变,并加剧了由Aβ 25-35引起的SHSY5Y细胞线粒体形态异常,如线粒体肿胀、空泡化增加和线粒体嵴缺失;荧光及ROS定量检测结果均显示10uM simvastatin预处理后,细胞内活性氧水平较单独Aβ 25-35干预组更高;CCK8结果也显示simvastatin干预后,加剧了由A β 25-35引起的SHSY5Y细胞活性的下降。因此,通过simvastatin抑制甲羟戊酸通路后加剧了 A β 25-35对SHSY5Y细胞的毒性。3.通过SPTLC-1 siRNA阻断神经酰胺信号通路抑制了 Aβ诱导的SHSY5Y细胞的UPRmt反应,且加剧了 Aβ的细胞毒性作用3.1有文献报道线虫中负责生成神经酰胺的鞘脂生物合成信号通路为激活UPRMT程序的必要条件。为研究其是否也参与AD细胞模型中UPRmmt反应的激活,我们应用SPTLC-1siRNAs来阻断鞘脂生物合成通路。首先检测到经20uM A β 25-35干预4h后,SHSY5Y细胞内SPTLC-1蛋白表达增加。与转染对照组小干扰相比,转染SPTLC-1siRNA 48h后细胞内SPTLC-1蛋白水平明显下降。在没有Aβ干预的条件下,UPRmt相关蛋白在转染对照组和SPTLC-1小干扰组细胞内的表达没有明显的统计学差异。我们还发现转染不同序列SPTLC-1 siRNA后,20uM Aβ干预的 SHSY5Y 细胞内 UPRmt 相关蛋白 HSP60、LONP1、HtrA2/Omi、CLPP 表达较对照转染组下降。因此,通过抑制神经酰胺信号通路可以降低细胞内由Aβ引起的UPRmt的激活。3.2为进一步研究抑制神经酰胺信号通路对细胞的影响,我们又检测了转染SPTLC-1siRNA后线粒体形态,细胞内ROS水平及细胞活性改变。结果显示,转染SPTLC-1siRNA后,加剧了由Aβ 25-35引起的SHSY5Y细胞线粒体形态异常,如线粒体空泡化增加和线粒体嵴缺失;荧光及ROS定量检测结果均显示转染SPTLC-1siRNA后,细胞内活性氧水平较单独Aβ 25-35干预组更高;CCK8结果也显示转染SPTLC-1siRNA后,SHSY5Y细胞存活率较单独A β 25-35处理组下降。因此,通过SPTLC-1 siRNA抑制神经酰胺信号通路后加剧了 A β 25-35对SHSY5Y细胞的毒性。4.稳定过表达APPsw基因可以引起HEK293细胞内UPRmt的改变,且甲羟戊酸通路在UPRmt中发挥重要作用4.1在上述研究中我们发现,在经Aβ细胞外干预的SHSY5Y细胞中及APP/PS1转基因小鼠中都存在UPRmt的激活。为了检测内源性过表达APPsw基因后是否会引起同样的UPRmt反应,我们采用Western blot方法检测HEK293和20E2细胞中UPRmt相关蛋白的表达。结果显示,与HEK293细胞相比,20E2细胞中UPRmt相关蛋白Hsp60的表达明显增加。但是,另外两个UPRmt相关蛋白HtrA2/Omi、CLPP在20E2细胞中的水平却比HEK293细胞下降。上述结果提示与HEK293细胞相比,稳定过表达APPsw基因后细胞内UPRmt相关蛋白的表达有所改变。4.2在上述研究中我们发现,通过HMGCS-lsiRNAs或他汀阻断甲羟戊酸通路会抑制由A β所诱导的SHSY5Y细胞中UPRmt的激活。在该项研究中我们利用HMGCS-1shRNA来干扰甲羟戊酸通路,然后检测该通路是否参与了 20E2细胞中UPRmt的改变。首先我们发现与HEK293细胞相比,20E2细胞中HMGCS-1蛋白表达明显下降。与转染对照组shRNA相比,转染HMGCS-1 shRNA 48h后细胞内HMGCS-1蛋白水平明显下降。从图2B的结果中我们发现,与转染对照组shRNA相比,转染HMGCS-1shRNA后HEK293细胞中UPRmt相关蛋白的水平无明显改变。但与转染对照组shRNA相比,转染HMGCS-1shRNA后20E2细胞中UPRmt相关蛋白Hsp60、HtrA2/Omi、CLPP的表达均减少。上述结果表明,通过HMGCS-1shRNA干扰甲羟戊酸信号通路后20E2细胞中UPRmt相关蛋白表达下降,甲羟戊酸途径参与了 20E2细胞中UPRmt的改变。4.3为了进一步验证甲羟戊酸途径参与20E2细胞中UPRmt相关蛋白的表达,在转染HMGCS-1 shRNA或对照shRNA 48h后,再给与100uM甲羟戊酸盐干预4h,收集细胞并western blot检测细胞中UPRmt相关蛋白的表达。结果显示,在对照shRNA转染组,给与甲羟戊酸盐干预后细胞内UPRmt相关蛋白水平与单纯转染组无明显统计学差异。但在HMGCS-lshRNA转染组,给与甲羟戊酸盐干预后细胞内UPRmt相关蛋白Hsp60、HtrA2/Omi、CLPP的表达水平较单纯转染组明显升高。上述结果表明,补充甲羟戊酸盐后可以缓解由HMGCS-1shRNA所引起的20E2细胞中UPRmt的下降,从而进一步证明了甲羟戊酸途径在介导20E2细胞中UPRmt激活中发挥重要作用。结论1.在A β处理的SHSY5Y细胞中和APP/PS1小鼠中均存在UPRmt的激活。2.在SHSY5Y细胞中,由Aβ所诱导的UPRmt激活依赖甲羟戊酸和神经酰胺两条信号通路的调节。3.抑制上述两条通路加剧了 A β对SHSY5Y细胞的毒性,进而提示抑制UPRmt的激活加剧了Aβ对细胞的损伤,为UPRmt在AD中的保护作用提供了依据。4.与HEK293相比,过表达APPsw基因可以引起细胞内UPRmt的下降,且UPRmt的减弱可能与甲羟戊酸通路中HMGCS-1蛋白水平降低有关。意义本项研究明确了 AD中UPRmt的变化及激活UPRmt所需的两条通路,并为UPRmt在AD中的保护作用提供了依据,有助于我们进一步了解AD的发病机制并为AD的治疗提供了新的靶点。