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研究目的：Obg-like ATPase 1(OLAl,也称DOC45)是一种p-loop GTP酶,属于TRAFAC(翻译因子相关)类,Obg家族和YchF亚群,可能在细胞中作为翻译因子和核糖体连接蛋白,信号转导,细胞内运输和应激反应的蛋白存在。但是,目前的研究对于YchF/OLA 1蛋白在生命发生发展过程中的作用尚不明确。同时,目前也缺乏研究OLA1功能直接和有意义的模型。研究内容和方法：建立Ola1基因敲除的小鼠(Ola1-/-),以正常基因型小鼠(Ola1+/+)为对照,观察Ola1-/-胚胎和器官的生长和发育,及小鼠的生长；建立和培养原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),从分子水平研究Ola1-/-小鼠出现增殖和发育阻滞的原因；前期的研究中小鼠胚胎发育的阻滞归因于细胞周期检查点蛋白p53和p21在Ola1-/-MEF细胞和胚胎中的累积,那么进一步我们将对OLA1调节p53和p21蛋白表达的分子机制进行初步的探索。研究结果：我们第一次分析了Olal无义突变的小鼠,发现Olal被完全敲除后,会引起小鼠严重但是不完全的围生期死亡。所有的Ola1-/-胚胎均表现为生长迟滞伴随发育延迟,最终导致出生时器官发育不完全,尤其是肺。原代培养的Olal-/-MEF细胞也表现出明显的细胞增殖能力降低,这主要归因于细胞周期中G1到S期的阻滞,而与凋亡无关。这种细胞周期的阻滞是由cyclinD1、cyclinEl和pRb的降低和p53、p21的堆积所致。通过基因转录、polysome profiling和蛋白降解的研究,结果揭示了Olal-/-MEF细胞中p53和p21的累积分别是由蛋白稳定性的增加和翻译效率的提高所引起的。更重要的是,p21的调节是非p53依赖的,这一点,我们在Ola1-/-胚胎中也得以验证。总的说来,我们的数据第一次指出OLA1作为一个翻译性的GTP酶,通过一种特别的翻译／翻译后机制调控p21和p53的表达,Ola-/-细胞中p53的累积归因于蛋白稳定性的增高,而p21的累积归因于p21mRNA中缺乏上游开放阅读框(uORF)的5’UTR变异体翻译的加强,而这些在维持足够的细胞增殖和发育的完整性上有重要的作用。以上结果表明OLA1是Gl/S检查点通路中p53/p21轴的重要调节分子,在细胞增殖、动物和胚胎发育和生物体生长中发挥着至关重要的作用。结论与创新目前为止,OLA1相关的研究仍较少,而在本研究之前,尚没有文章对OLA1在胚胎发育中的作用进行阐述。而OLA1又是一个非常重要的可调控多种通路的重要蛋白,包括在氧化应激中[1],在乳腺癌、结直肠癌、肺癌的运动和侵袭中[2-4]。而研究OLA1在胚胎发育中的作用可以为我们之后研究OLA1的机制,尤其是与肿瘤的关系提供基础和依据,同时我们建立的Ola1基因敲除的小鼠模型和原代培养的MEF细胞可以作为之后OLA1功能和机制研究的重要工具和手段。1.本文第一次报道了Ola1基因敲除的小鼠的表型。Ola1基因敲除的小鼠80%以上会出现围生期死亡,且这种死亡原因主要为肺部发育不成熟导致的肺不张。而另外少量的生存下来的Ola1-/-小鼠生长到成年仍然表现出“个头”明显小于对照组的情况。而这些变化并不会引起小鼠的寿命和生殖方面的影响。2.本文第一次证明了OLA1可以通过抑制p53和p21的表达促进细胞周期,当Ola1被敲除后会出现细胞周期阻滞,而这种阻滞直接导致胚胎的生长发育受阻,并引起小鼠的围生期死亡,说明了OLA1在小鼠胚胎发育中的重要作用。3.本研究为进一步研究OLA1在肿瘤中的作用提供了基础,p53和p21在肿瘤中都是相当重要的,既有抑癌功能,又有促癌作用,而OLA1可以调节p53和p21的蛋白表达,间接表明OLA1与肿瘤有着非常重要的联系。虽然目前一些研究已经揭示了OLA1与肿瘤的相关性,但机制仍然不明确,本文可为这些进一步的肿瘤研究提供基础。