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研究目的:莪术醇是临床上抗肿瘤中药莪术挥发油的主要成分,属于天然倍半萜类化合物,对多种肿瘤细胞均有着良好的抑制作用,但目前莪术醇的药代动力学和毒理学研究仍不充分,极大限制了莪术醇单体的进一步开发。本课题采用了规范的药代动力学和毒理学实验手段,研究了莪术醇的大鼠体内吸收、组织分布和血浆蛋白结合率等药代动力学特征,并开展了莪术醇的大鼠28天重复给药毒理学研究,阐明了莪术醇在大鼠体内的药代动力学和毒理学特征,为进一步推动抗肿瘤中药单体莪术醇的药物开发提供了依据。研究方法:1.莪术醇的大鼠吸收和分布研究（1）开发测定大鼠生物样本中莪术醇的分析方法并进行方法学验证,系统考察分析方法的专属性、标准曲线与定量范围、精密度和准确度、基质效应、提取回收率和稳定性。（2）给SD大鼠灌胃给予莪术醇10、40和80 mg/kg,于给药后0、0.083、0.25、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24 h收取血浆,采用LC-MS/MS方法测定莪术醇的体内吸收动力学参数。（3）采用LC-MS/MS方法检测莪术醇40 mg/kg灌胃后SD大鼠脑、心、脾、肺、小肠、结肠、肝、肾中莪术醇的分布情况。（4）研究了莪术醇100、300和600 ng/m L与大鼠血浆的蛋白结合率情况。2.莪术醇的大鼠毒理学研究2.1莪术醇毒理学研究的给药制剂筛选研究采用五种不同的溶剂（配方1:50%橄榄油水溶液;配方2:50%1,2-丙二醇水溶液;配方3:去离子水加10%乙醇和10%Kolliphor HS15;配方4:去离子水加10%乙醇和10%1,2-丙二醇;配方5:0.5%CMC-Na水溶液）配制100 mg/m L莪术醇,用LC-MS/MS方法测定各莪术醇给药制剂的吸收动力学参数,以确定更适合暴露莪术醇毒性风险的给药制剂。2.2莪术醇大鼠28天重复给药毒性研究SD大鼠连续28天每天1次灌胃给予莪术醇250、500、1000 mg/kg研究其在大鼠中的毒理学特征。（1）观察大鼠临床症状、死亡情况、体重和摄食量指标。（2）给药结束期检测大鼠血液学和血清生化学指标。（3）记录脑、心、脾、肺、小肠、结肠、肝、肾等组织脏器重量并计算脏器-体重系数和脏器-脑重系数。（4）对脑、心、脾、肺、小肠、结肠、肝、肾等组织脏器进行组织病理学检查。2.3莪术醇的血液学毒性的机制研究用莪术醇0～100μM处理大鼠外周血单核细胞36 h后,采用流式细胞仪检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD19+B细胞的细胞比例,研究莪术醇对不同亚型的淋巴细胞毒性。研究结果:1.莪术醇的大鼠吸收和分布研究（1）建立LC-MS/MS莪术醇大鼠生物样本检测方法,ACQUITY UPLC I-Class液相系统配备ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱对莪术醇进行分离,多重选择反应监测模式下对莪术醇正离子进行定量。（2）方法学验证结果表明,莪术醇标准曲线的线性关系良好（r~2＞0.993）。莪术醇的质控样品的日间精密度介于1.7%～10.7%,日内精密度介于0.9%～12.3%,日间准确度和日内准确度均在±15.0%以内,提取回收率超过89.0%,生物基质对莪术醇的检测无干扰。莪术醇在室温、多次冻融和长期冷冻条件下稳定性良好。（3）大鼠体内吸收动力学参数结果显示,莪术醇10、40、80 mg/kg灌胃后在大鼠体内Tmax小于1.0 h,半衰期为3～5 h,AUC在128～746μg/L*h,Cmax在56～237 ng/m L,表明莪术醇在大鼠体内可以迅速的被吸收和消除,且AUC和Cmax随剂量成线性增加。（4）组织分布结果显示莪术醇40 mg/kg灌胃后,0.5～1 h在大脑、心脏、脾脏、肺、小肠、肝、肾中莪术醇达到最高浓度,表明莪术醇在组织中分布迅速而广泛。8 h后,各组织中莪术醇的浓度均明显下降,表明莪术醇在体内没有蓄积。（5）莪术醇100～600 ng/m L的大鼠血浆蛋白结合率在85.6%～93.4%。2.莪术醇的大鼠毒理学研究2.1莪术醇毒理学研究的给药制剂筛选研究比较5种给药制剂配制的莪术醇1000 mg/kg灌胃后大鼠的药代吸收参数,采用去离子水加10%乙醇和10%Kolliphor HS15配制的100 mg/m L莪术醇给药制剂,在大鼠体内t1/2=0.8 h,Cmax=1915 ng/m L,AUC0-t=10321.8μg/L*h。结果表明,莪术醇在该制剂配制下既增加了莪术醇的水溶性,也保持了莪术醇相对较高的血浆水平,可充分暴露莪术醇的毒性,后续的大鼠重复给药毒性研究采用该制剂配方进行。2.2莪术醇的大鼠28天重复给药毒性评价（1）莪术醇250、500和1000 mg/kg连续给药28天对大鼠临床症状、体重和摄食量无明显影响。（2）大鼠的肝脏、卵巢、睾丸、脾脏重量有一定增加,其他脏器重量未见明显改变,提示莪术醇可能对肝脏、卵巢、睾丸、脾脏有一定毒性作用。（3）血液学参数结果表明,雄性大鼠的白细胞计数、红细胞计数、淋巴细胞减少,中性粒细胞增加,提示莪术醇可能具有潜在的血液毒性。血清生化结果显示,丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总胆红素、钠离子水平明显改变,提示莪术醇可能有潜在的肝脏损伤、胆红素淤积和离子转运水平影响。（4）组织病理学结果显示,莪术醇给药大鼠各组织脏器没有明显损伤。2.3莪术醇血液学毒性的机制研究流式细胞术检测结果显示莪术醇0～100μM处理外周血单核细胞后,CD19+B细胞比例从22.6%降至8.55%,CD8+T细胞比例从11.65%降至6.25%,CD19+B细胞和CD8+T细胞的比例以浓度依赖性方式明显下降,而CD4+T细胞的比例保持不变,提示莪术醇对CD19+B细胞和CD8+T细胞有一定的毒性。研究结论:本课题探索了莪术醇在大鼠体内的吸收、分布特征,结果表明莪术醇在大鼠体内能被迅速吸收和消除,组织分布广泛,且有较高的血浆蛋白结合率,药代动力学特征提示莪术醇进一步开发可以通过制剂研究延长药物的半衰期,增加药物的血浆暴露量。莪术醇大鼠28天重复给药毒性研究表明,大鼠对莪术醇耐受性良好,雌雄大鼠均无明显毒性临床症状。莪术醇并未引起大鼠组织病理学损伤,但是血液学、生化学指标变化和脾脏、肝脏、卵巢、睾丸重量增加提示莪术醇可能有一定的免疫抑制作用和肝脏、生殖器官损伤,进一步开发莪术醇单体抗肿瘤药物需要额外关注这些潜在的毒性反应。