生物起搏近年来已成为心脏起搏的研究热点。所谓生物起搏，就是利用具有起搏或传导功能的细胞、组织来替代病变或损伤的起搏和传导组织，重建心脏正常的起搏和传导功能。目前，实现生物起搏的主要策略有：基因治疗、干细胞移植和组织工程构建。从理论上讲，用再生医学的理念构建出生物起搏器不仅具有较高的安全性和自控性，并能克服电子起搏器的诸多缺陷，是未来治疗各型心律失常的理想选择和发展方向。种子细胞是生物起搏的关键环节之一，因此，研究干细胞向起搏细胞的分化及机制，寻找可用于替代移植的种子细胞，具有重要的理论和临床意义。目前，生物起搏研究领域中所用的种子细胞主要包括（1）成体细胞：窦房结细胞、幼稚心脏细胞及经基因修饰的心肌工作细胞；（2）全能干细胞：胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)；（3）成体多能干细胞(somatic multipotent stem cells, SMSC),：来源于骨髓、脐带血、月经血、羊膜、脂肪等组织的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)。其中，脂肪来源的干细胞以其诸多优点具有广阔的应用前景。有研究表明，棕色脂肪组织中可以分离、培养出自发搏动的心肌样细胞，我们前期的工作也初步证明，这种起搏细胞具有起搏细胞的特征。然而，起搏样细胞是由棕色脂肪组织中的脂肪间充质干细胞还是心脏祖细胞分化而来的还不甚明确；棕色脂肪来源的干细胞向起搏样细胞分化的过程和机制也尚未完全阐明。因此，本课题旨在通过研究棕色脂肪中分离出的干细胞的生物学特性，进一步研究其分化过程和验证其分化后的起搏特征，并探讨它分化的可能机制，来为未来以棕色脂肪源性干细胞（brown adipose-derived stem cells, BASCs）为种子细胞构建生物起搏器奠定理论基础。第一部分棕色脂肪源性干细胞的生物学特性研究目的：明确棕色脂肪源性干细胞的生物学特性。材料和方法：取7~9周C57BL/6小鼠肩胛间棕色脂肪组织，经胶原酶消化离心后，取下层间充质干细胞分别进行表面抗原、三向分化能力和常规培养后早期细胞成分的检测。结果：1.新鲜分离的BASCs表达间充质干细胞（CD29、CD44、CD90和CD105）和造血系干细胞（CD34和CD45）的标志，不表达心脏干细胞（c-kit和Sca-1）标志；2.通过特定的诱导培养后，BASCs能完成成脂、成骨和成软骨的定向分化，其间未见任何一组有自发的成肌分化；3.常规培养3天后，BASCs高表达间充质干细胞标志（90%以上），不表达造血系干细胞标志，同时还存在成簇分布并表达心脏干细胞标志c-kit和Sca-1的细胞。结论：原代分离的BASCs是中有来源于间充质的干细胞群，但不包含心肌祖细胞；通过常规培养即能使BASCs得到初步纯化并形成以间充质干细胞为主的细胞群。第二部分棕色脂肪源性干细胞向起搏样细胞的分化研究目的：研究分化后具有自发搏动功能BASCs的起搏特性。材料和方法：将分离的BASCs在15%FBS/DMEM中进行常规培养，记录细胞分化过程中的形态学变化，在分化良好的搏动细胞中检测窦房结(sinoatrial node, SAN)起搏细胞的特异性标志，并用real time PCR和Western Blot分别检测不同时相点的表达变化，用透射电镜观察细胞的超微结构，应用细胞内钙成像技术和膜片钳技术检测其电生理特性，药理学实验检测细胞表面β和M受体的功能。结果：BASCs在15%FBS/DMEM中常规培养后即可观察到分化良好、自主搏动的肌管状和小圆形细胞，qPCR分析显示BASCs在分化过程中表达SAN细胞的特异性结构基因Sr、cTNT、Cx30.2和HCN4，其表达量随时间延续而上调（上升幅度在不同时相点不均一）；Western Blot证实上述结构蛋白的含量随时间的延续有所积累，免疫荧光也验证了相应的定位表达。此外，透射电镜下可观察到发育不全和排列紊乱的肌丝、肌节结构。分化后的BASCs存在自发钙瞬变现象，同时也可经电刺激产生对应频率的周期性胞内Ca2+浓度变化，并可记录到起搏细胞特征性的4期自动去极化动作电位；心血管活性药物对其搏动频率有明显的影响。结论：BASCs在15%FBS/DMEM培养条件下可以分化为自发搏动的细胞，它们具有SAN细胞的起搏特性和药理学反应。第三部分Tbx18在BASCs向起搏样细胞分化中的作用研究目的：研究Tbx18在BASCs向起搏样细胞分化过程中的作用，并探讨其可能机制。材料和方法：首先在BASCs自然分化过程中检测窦房结发育相关转录因子Tbx18、Tbx3、Shox2等的表达情况；然后，利用RNA干扰技术在分化全程下调Tbx18的表达，通过形态学观察其分化的情况和程度，应用Western blot在蛋白水平上检测Tbx18下调后其下游的相关起搏基因和特异性结构蛋白的表达变化情况。结果：BASCs自然分化时，在RNA和蛋白水平上均可检测到Tbx18及其下游转录因子Shox2和Tbx3的上调现象，但未检测到Nkx2.5的表达。通过慢病毒载体转染Tbx18特异性的干扰片段可以有效地下调其在BASCs中的表达，被干扰的细胞自主分化能力减弱，表现为分化的细胞减少、肌管样结构发育不良，自发性搏动消失。Shox2和Tbx3也随之表达下调，但是促进向心肌工作细胞发育的基因Nkx2.5在蛋白水平上始终未能检测到。在Tbx18实施RNA干扰后，SAN起搏细胞的结构蛋白在BASCs中也随之减少。结论：Tbx18在BASCs向起搏样细胞的分化中可能发挥了重要的正向调控作用。