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在我室的基因治疗研究中，核糖体基因区(rDNA)由于其安全性及高效率，一直是我们进行基因打靶的重要目的区域。我室也已经成功构建多种针对此区域的非病毒打靶载体—核糖体基因区靶向载体，这些同源重组载体能携带多种治疗基因在多种细胞系中成功打靶rDNA区+5468位点，且外源基因能长期稳定地表达。TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）是一种崭新的用于基因编辑的分子生物学工具。利用TALE的序列模块与内切核酸酶FokI偶联，可构建成剪切任意特异DNA序列的核酸内切酶TALEN，从而介导高效率的同源重组。以此核酸酶为剪切工具，或许能进一步提高rDNA区的打靶效率。而由于TALEN切割内源性DNA后产生的DNA双链断裂(DSB)通过NHEJ（非同源末端重接）进行修复而产生不可预知突变的概率较高，核糖体基因区为高拷贝，其TALEN打靶过程中产生的突变会严重扰乱基因组，影响细胞的存活及同源重组的效率。近期研究显示，以核酸酶为基础的核酸切口酶(Nickase)的应用可有效降低NHEJ引起的突变，促进同源重组。 目的：研究特异识别与切割核糖体基因区5468位点的TALENs及TALE Nickases对rDNA区同源重组的促进作用。 方法：⑴以限制性酶切连接的模块组装方法构建rDNA区5468位点特异性的TALENs;⑵将下游的TALENs中FokI的催化域进行点诱变，使FokI单体失活而形成Nickases;⑶用PCR的方法克隆5468位点约1kb的长同源臂、约600bp的短同源臂体及用于 Southern检测的探针序列，连接构建为无筛选基因的、用于检测TALENs对同源重组促进强度的打靶载体F9-Pro;⑷用TALENs及Nickases联合F9-Pro及PHmF9打靶HT1080细胞及293T细胞，以定点整合PCR、测序等方法鉴定同源重组。 结果：①经过酶切、测序、PCR等方法的鉴定，鉴定结果均符合理论预期，说明成功构建了序列正确的5468位点特异性的TALENs、TALENickase及小型打靶载体F9-Pro质粒;②以TALENs及TALENickases联合F9-Pro打靶293T细胞3天后，在未经过克隆筛选的条件下，混合细胞经定点整合PCR的半定量分析发现了较明显的同源重组，而并未在单转F9-Pro的对照组中发现同源重组;③以TALENs及TALENickases联合pHmF9打靶HT1080细胞约半个月后，经克隆筛选及鉴定发现，突变过的TALENickases组的抗性克隆的数目比于野生型的TALENs组及单转PHrnF9的组多6-8倍，TALENickases组及TALENs组阳性克隆的比例高达75％-83％，明显高于而单转pHrnF9的组(45％)。 结论：构建的TALENs及TALENickases起到了明显的促进rDNA区同源重组的作用，且TALENickases在提高同源重组效率的同时明显降低了细胞毒性，为今后我组rDNA区打靶的研究提供了有效的工具。