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目的:近端小管起始于肾小球的尿极,是肾小管的起始段,具有较强的重吸收功能,原尿中的全部葡萄糖、氨基酸、蛋白质、65%的钠离子和水、50%的尿素都在此段吸收,这种重吸收功能依赖于近端小管的上皮结构及转运功能。肾近端小管也是肾缺血、缺氧及高糖应激中易受损伤也易被修复的节段。传统形态学按近端小管走行,将其分为曲部和直部;按超微结构的不均一性,将近端小管分为S1、S2和S3三段,这种节段性的确立是建立在对大鼠、兔和人肾近端小管的超微结构体视学分析基础上的,并且在功能研究中也得到相对应的节段。很多小鼠近端小管的研究直接沿用这种节段性加以分析,但是,这种节段性已被证明有种属差异。目前尚缺乏对小鼠近端小管节段性的系统研究。本实验利用计算机辅助的三维重建技术,以小鼠肾组织连续切片形成的系列配准的显微图像为基础,结合超微结构体视学的方法,分别对起源于皮质三个水平的肾单位(SN、MN和JN)的近端小管亚细胞结构,如内吞体、线粒体、微绒毛等,以及上皮的高度、管径和管壁的容积等参数进行研究,探讨其管壁超微结构的变化规律及转运能力,旨在为肾脏生理机制及肾脏病的病变过程分析提供形态学基础。
实验方法:
1、树脂包埋连续切片的制备肾组织取自三只体重为25 g的C57/BL/6J小鼠,腹主动脉逆流固定(1%戊二醛和0.1 mol/L的二甲砷酸钠缓冲液配制,PH值7.4)。垂直于肾长轴取组织块,锇酸后固定2h,梯度酒精丙酮脱水后树脂812包埋。采用超薄切片机及钻石刀进行半薄切片,从肾被膜到肾外髓外带,共获2.5μm厚的连续切片720张,通过甲苯胺蓝染色显示组织微细结构。
2、显微图像获取与配准应用“计算机-显微镜-数码相机”图像采集系统(Olympus AX70显微镜;Olympus DP50相机,东京,日本),对连续切片进行显微镜下拍照。最终获得的图像大小为2596×1889像素,每个像素相当于1.16μm×1.16μm。图像配准过程在计算机Windows平台上操作。其原理是,通过比较相邻两幅图像内生理对应点的像素灰度值的相似性来确定每个图像平移及旋转,使其达到生理空间的一致。其过程是,首先得出相邻两幅图的相对变换值(平移距离和旋转角度),再通过求相对变换值的相加函数得出系列图像中的每幅图的绝对变换值,从而实现图像配准。
3、计算机辅助的近端小管数字追踪对成鼠肾单位肾小管进行数字追踪,追踪是通过C语言设计的程序在计算机Linux平台上实现的。近端小管的追踪起于肾小球尿极,终止于近端小管直部和髓袢降支细段上皮移行部。本实验追踪了3只小鼠150条近端小管,追踪过程自动生成一个数据文件,记录追踪小管走行的空间坐标。基于此坐标集,近端小管走行的毗邻关系分析,以及小管长度测量等得以实现。小管长度的测量运用欧几里德算法(n∑i=2√(xi-xi-1)2+(yi-yi-1)2+(zi-zi-1)2,即,累加沿近端小管走行的每两个连续点的距离,得出沿近端小管走行任意两点之间的距离。
4、体视学分析从肾小球开始到近端小管末端沿小管纵轴每隔300-400μm取切片获得超微结构图像,采用点计数法,利用10mm网格测试系统,在近端小管发放大倍数15600×的电镜图像上测细胞内吞体、溶酶体、线粒体等的体积密度。在2100×的电镜图像上测微绒毛长度、上皮高度、小管内外径等参数。
实验结果:
小鼠近端小管全程具有较为一致的超微结构,即,细胞游离面被覆长而致密的微绒毛,顶端细胞质内有许多大小不一的内吞体和顶端致密小管,在细胞顶端和细胞核之间有丰富的溶酶体和散在的线粒体,核下方和基底膜之间有垂直排列的质膜内褶,褶之间可见有杆状的线粒体。在近端小管的起始部,以及直部与细段移行处,细胞结构变化明显。近端小管曲部细胞的顶端有大量的脂滴和溶酶体,并且在起源于SN和MN的近端小管距肾小球900到2400μm段中,观察到细胞内存在有成层或者不均匀的高电子密度的溶酶体,但在JN中没有观察到。
形态计量学研究结果显示,小鼠近端小管刷状缘的高度不同于大鼠,全程变化不大,平均值约为2.7μm。管腔直径没有规律的节段性变化,平均值为22μm。SN和MN的近端小管细胞中,包括溶酶体的内吞体的体密度在近端小管曲部的中部有一个高峰为4%,在近端小管最后1000μm降低到2%,虽然沿近端小管有微小波动,但是没有看到像大鼠和人近端小管的节段性。SN、MN和JN的近端小管细胞中的线粒体的体密度平均值为44%,全程较为一致,没有发现大的节段性变化。
结论:
超微结构及体视学分析表明,该种属小鼠肾近端小管在溶酶体和线粒体的体密度、上皮高度、微绒毛高度等形态参数方面有量的变化,但是,并没有出现在人和大鼠肾近端小管上发现的明显三节段的结构变化。