论文部分内容阅读
酮体是乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮的总称,主要来源于脂肪酸,是脂质代谢的中间产物,可作为葡萄糖的替代能源。酮症酸中毒是一种病态的酮症,对人体有害,但生酮饮食（ketogenic diet,KD）或间歇性禁食等方式产生的轻度酮症状态在动物模型实验中被证实有益,可以改善机体代谢状况、延长寿命和改善神经系统功能。酮体参与调控许多已知的影响衰老的关键蛋白的表达活性;它们不仅可作为衰竭心脏的辅助燃料,还有改善内皮功能、缓解氧化应激、改善线粒体功能等多种有益作用。近年来,关于酮体在心脏相关疾病中的作用成为一个医学研究热点。目前研究很热的心脏相关的疾病模型包括心脏缺血/再灌注损伤、慢性心衰模型、年龄相关心脏衰老模型。本课题组已经完成酮体补充在心脏缺血/再灌注损伤和年龄相关心脏衰老模型中的作用研究,在慢性心衰模型中的研究尚在进行中。同时我们针对心脏缺血/再灌注损伤和年龄相关心脏衰老模型的特点,设计了不同的酮体补充方式:在心肌缺血/再灌注损伤小鼠中,我们使用D-β-羟基丁酸酯（D-β-hydroxybutyrate,BHB）进行治疗;在年龄相关心脏衰老模型中,我们采用了长期摄入KD的方法补充酮体。第一部分外源性酮体治疗对小鼠心脏缺血/再灌注损伤的保护作用研究以及相关机制的初步探索研究目的:本部分研究目的是明确酮体（D-β-羟基丁酸酯）在心脏急性I/R损伤中的治疗作用,并初步探讨其可能的作用机制。研究方法:1、将雄性C57小鼠随机分为3组,假手术治疗组（Sham）,空白试验组（I/R）,BHB治疗组（I/R+BHB）。每组饲养27只,检测各项指标时每组各取9只。小鼠行左前降支冠状动脉（LAD）结扎造成缺血,30min后将LAD结扎手术线切开以再灌注。再灌注5分钟前皮下植入渗透泵,BHB治疗组连续24小时输注BHB（1μl/h,1.6mmol/kg/24h）,假手术组和空白对照组植入充满生理盐水的泵,连续24小时输注等量的生理盐水。2、24h后,心脏切片,Evans blue和TTC双染并进行面积统计分析,计算梗死心肌的面积。3、利用超声心动图和左心室导管置入术检测小鼠心脏功能。主要测量指标为:射血分数（EF）,短轴缩短率（FS）,心室压力上升速率（+DP/dt）;心室压力下降速率（-DP/dt）。4、再灌注24小时后测量各项生化指标:包括血清中乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶（CK）水平、血清中的肌钙蛋白I（c Tn I）水平。TUNEL染色计数凋亡细胞并检测心肌中Caspase-3的活性以评估心肌中细胞凋亡程度。检测心肌组织中自噬相关指标:LC3-II/LC3-I比值、p62与溶酶体相关膜蛋白-2（Lamp2）的蛋白质表达来评估心肌细胞自噬流情况。检测心肌线粒体活性氧（ROS）形成、ATP产生、线粒体肿胀及线粒体膜电位（MMP）水平来评估心肌线粒体功能变化。二氢乙锭（DHE）染色与丙二醛（MDA）水平评估小鼠心肌的氧化应激情况。检测葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）和X盒蛋白1（XBP-1）的表达水平来评估心肌中内质网应激情况。研究结果:1、BHB治疗对小鼠心肌I/R损伤的影响:BHB治疗组梗死面积明显减少。BHB治疗显著降低了I/R小鼠血清中c Tn I、CK和LDH的水平。BHB治疗显著降低了I/R小鼠心肌TUNEL阳性细胞数目和Caspase-3的活性。2、BHB治疗显著增加I/R小鼠的EF、FS、+DP/dt、-DP/dt水平,缓解了I/R小鼠的心脏功能下降。3、BHB治疗对I/R小鼠心肌线粒体功能的影响:BHB治疗显著降低了I/R小鼠心肌中线粒体ROS水平,增加线粒体ATP生成,减轻线粒体肿胀,增加MMP。4、BHB治疗对I/R小鼠心肌氧化应激的影响:BHB治疗显著降低了心肌DHE染色荧光强度,减少了心肌MDA的生成。5、BHB治疗对I/R小鼠心肌内质网应激的影响:免疫组化和RT-PCR检测发现BHB治疗显著降低了I/R小鼠心肌组织中GRP78、CHOP和XBP-1的表达水平。6、BHB治疗对I/R小鼠心肌中自噬流的影响:BHB治疗降低了I/R小鼠心肌中LC3-II/LC3-I比值和p62表达,同时增加了I/R小鼠心肌中Lamp2的蛋白表达,提示BHB治疗促进了I/R小鼠心肌中自噬流水平。研究结论:外源性BHB可减轻小鼠心肌I/R损伤,改善I/R小鼠心脏功能。其中涉及的机制包括改善心肌细胞内线粒体功能、减轻氧化应激及内质网应激,以及促进I/R小鼠心肌中自噬流水平。第二部分生酮饮食对慢性衰老相关心肌重塑和心脏功能障碍的保护作用研究以及相关机制的初步探索研究目的:本部分研究采取长期摄入KD的方式在小鼠体内维持一定水平的酮体,尝试改善小鼠衰老相关的心肌重塑和心脏功能下降,并对涉及的分子机制进行初步探索。研究方法:1、8周龄和20个月龄的C57小鼠喂食标准饮食或KD,喂养4个月。小鼠分为四组:成年正常饮食组（成年组,Adult）、成年KD组（Adult+KD）、老年正常饮食组（老年组,Aged）、老年KD组（Aged+KD）。每组饲养28只,检测各项指标时每组7只。2、定期测定血浆中的β-羟基丁酸酯水平,以确定KD的生酮效果。3、喂食4个月后,通过超声心动图评估心脏功能。主要检测指标:左室收缩末期直径（LVESD）、FS。4、喂食4个月后,进行心肌各项指标检测。检测心肌细胞横截面积（CSA）、心脏重量和心房钠尿肽（ANP）的m RNA表达来评估心肌肥大情况。检测心肌纤维化以及α1-I型胶原基因（Col1A1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的m RNA表达情况。检测MDA、3-硝基酪氨酸（3-NT）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）及谷胱甘肽/氧化谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比值对氧化应激进行评估。检测CHOP、GRP78、cleaved激活转录因子6（ATF6）和XBP1s表达来评估内质网应激情况。检测心肌中线粒体ROS形成、ATP产生、MMP、烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸细胞色素还原酶（NCCR）和琥珀酸细胞色素c还原酶（SCCR）活性来评估线粒体功能。检测心肌P62蛋白、Lamp2蛋白表达及LC3-II/LC3-I比值水平来评估自噬流情况。研究结果:1、摄入KD显著升高小鼠血浆中的β-羟基丁酸酯水平。2、KD喂养对老年小鼠心脏功能的影响:超声心动图结果显示,在老年小鼠中,长期摄入KD可以显著降低LVESD,增加FS水平。3、KD喂养对老年小鼠心肌肥大和纤维化的影响:在老年小鼠中,KD可以显著降低心肌细胞横截面积（CSA）、心脏重量、肌胶原容积分数;在分子水平,KD可以显著降低老年小鼠心肌中ANP、Col1A1和α-SMA的m RNA表达水平。4、KD喂养对老年小鼠心肌氧化应激的影响:在老年小鼠中,KD可以显著降低心肌中MDA和3-NT水平,增加心肌中SOD和CAT活性,增加心肌GPx活性和GSH/GSSG比值。5、KD喂养对老年小鼠心肌内质网应激的影响:在老年小鼠中,长期摄入KD可以显著降低心肌中cleaved ATF6、CHOP和XBP1s表达水平。6、KD喂养对老年小鼠心肌线粒体功能的影响:在老年小鼠中,长期摄入KD可以显著减少线粒体ROS生成,增加ATP合成,增加线粒体呼吸链复合酶III活性,维持复合体I和III之间及复合体II和III之间电子偶联能力的活性。7、KD喂养对老年小鼠心肌自噬流的影响:在老年小鼠心肌组织中,长期摄入KD可以显著增加LC3-II/LC3-I比值,增加Lamp2表达,降低P62蛋白表达,提示KD对心肌自噬流存在促进作用。结论:长期摄入KD可以减轻老年小鼠的心肌细胞肥大和心肌组织纤维化,缓解老年小鼠的心脏功能下降。长期摄入KD可以减轻老年小鼠心肌中氧化应激及内质网应激、改善线粒体功能,并可促进自噬流。