【摘 要】
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目的:研究PFOA诱导人肝细胞L02线粒体途径凋亡的过程,并探索Lonp1参与调节该过程的机制。方法:1、本实验以人肝细胞L02作为研究对象,用不同浓度的PFOA作用于L02细胞24 h后,使用CCK-8方法测定细胞的存活率,以确定PFOA的后续工作浓度。设置对照组（C组）、低剂量组（L组）、中剂量组（M组）、高剂量组（H组）,用不同剂量PFOA处理细胞24 h后用细胞凋亡试剂盒、活性氧簇（ROS
【基金项目】
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国家自然科学基金（82060598）； 贵州省科学技术基金（黔科合基础[2020]1Y146;黔科合基础-ZK[2021]一般181）； 遵义医学院优秀青年人才项目（17zy-006）；
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目的:研究PFOA诱导人肝细胞L02线粒体途径凋亡的过程,并探索Lonp1参与调节该过程的机制。方法:1、本实验以人肝细胞L02作为研究对象,用不同浓度的PFOA作用于L02细胞24 h后,使用CCK-8方法测定细胞的存活率,以确定PFOA的后续工作浓度。设置对照组（C组）、低剂量组（L组）、中剂量组（M组）、高剂量组（H组）,用不同剂量PFOA处理细胞24 h后用细胞凋亡试剂盒、活性氧簇（ROS）检测试剂盒、JC-1探针、Fluo-4 AM(Ca2+荧光探针)分别测定四个组细胞的凋亡率、细胞内ROS的水平、线粒体膜电位（ΔΨm）变化和细胞内Ca2+的浓度,最后用Western blot方法测定相关蛋白Lonp1、Trap1、TXNIP、CYPD、Bax、Bak、Bim、Cyt-c、Caspase-9、Bcl-2、GRP78、CHOP、Sig-1R及IP3R3的表达。2、用2μmol/L Lonp1抑制剂（CDDO-me）预处理细胞2 h,使用Western blot方法测定CDDO-me对L02细胞内Lonp1蛋白的抑制情况。设置对照组（C组）、PFOA低剂量组（L组）、PFOA中剂量组（M组）、PFOA高剂量组（H组）,抑制剂预处理对照组（C+组）、抑制剂预处理+PFOA低剂量组（L+组）、抑制剂预处理+PFOA中剂量组（M+组）、抑制剂预处理+PFOA高剂量组（H+组）。使用CDDO-me和PFOA作用L02细胞至规定时间后,采用Western blot方法测定相关蛋白CYPD、Bax、Bcl-2、Cyt-c、GRP78、CHOP、Sig-1R的表达。分别使用Fluo-4 AM(Ca2+荧光探针)、细胞凋亡试剂盒检测细胞内Ca2+浓度和凋亡率。结果:1、细胞存活率:PFOA浓度低于64μmol/L时各个组的细胞存活率与对照相比没有显著差异（P＞0.05）,随着PFOA浓度增加至64μmol/L及更高时,细胞存活率显著降低（P＜0.05）,PFOA浓度约为256μmol/L时为半数致死量。2、细胞凋亡率:与C组比较,L组的凋亡率没有差异,而M、H组凋亡率显著增高,分别为13.2%±2.2%、29.6%±5.4%（P＜0.05）。3.细胞内ROS水平:与C组比较,L组的ROS含量略微升高,但没有显著差异（P＞0.05）,M、H组较C组ROS水平分别增高了约1.7±0.2倍、2.4±0.3倍（P＜0.05）。4、细胞内线粒体膜电位水平:与C组比较,L组的线粒体膜电位没有显著变化（P＞0.05）,M组和H组的膜电位显著降低（P＜0.05）,M组降低了60.5%±7.0%,H组降低了76.5%±1.3%,并且在一定范围内有剂量依赖关系。5、细胞内Ca2+浓度:与C组比较,L组的细胞内Ca2+浓度变化无显著差异（P＞0.05）,M组和H组的细胞内Ca2+浓度显著升高（P＜0.05）,并且在一定范围内呈现剂量依赖,M组细胞内Ca2+浓度为对照的1.32±0.02倍,H组细胞内Ca2+浓度为对照的2.79±0.08倍。6、凋亡相关蛋白表达情况:与C组比较,L、M、H组中Lonp1、Trap1、Bcl-2、Sig-1R表达逐渐降低,TXNIP、CYPD、Bax、Bak、Bim、Cyt-c、Caspase-9、GRP78、CHOP、IP3R3表达逐渐升高,在H组中蛋白的表达改变与C组相比尤其显著（P＜0.05）。7、2μmol/L CDDO-me预处理后凋亡相关蛋白的表达情况、Ca2+浓度和凋亡率:与C、L、M、H组分别相比较,CYPD、Bax、Cyt-c、GRP78以及CHOP在C+、L+、M+、H+组中的表达显著增加（P＜0.05）,而Bcl-2和Sig-1R的表达结果呈现显著降低的趋势（P＜0.05）。C+、L+、M+和H+组中Ca2+浓度和凋亡率分别较C、L、M和H组中高（P＜0.05）,并随着PFOA浓度的增加呈剂量依赖性增加。结论:1、PFOA通过诱导L02人肝细胞内ROS含量上升、降低细胞内膜电位水平,扰乱细胞内钙离子稳态,促进线粒体途径中促凋亡蛋白的表达,抑制线粒体途径中抗凋亡蛋白的表达,使得细胞的凋亡率增加,从而诱导细胞毒性,导致细胞存活率降低。2、抑制Lonp1可增加促凋亡蛋白CYPD、Bax、Cyt-c、GRP78以及CHOP的表达以及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Sig-1R的表达,并且可加剧细胞内Ca2+浓度升高及凋亡率上升,即抑制Lonp1可增强PFOA诱导人肝细胞L02线粒体途径凋亡,Lonp1受到抑制会增加PFOA肝脏毒性的敏感性。
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