研究背景： 痔(Haemorrhoids)是普外科的常见病和多发病(发病率约为4﹪-36.4﹪)。目前认为痔是肛垫的下移及其支持结构、血管丛及动静脉吻合发生的病理改变。虽然痔的治疗方法有多种，但疗效褒贬不一。究其原因，还在于人们对于痔的本质尚未完全弄清，有关的发病机制还存在争论。 既往人们发现痔组织中存在扩张的静脉，认为痔是直肠痔上静脉丛异常扩张所致，痔静脉扩张与人的直立体位以及所受的液体静力压有关，同时门脉高压也是痔的诱发因素。但随后不断有研究发现直肠肛管区组织中存在门体静脉的交通血管，而且在胎儿和正常肛管中也存在扩张血管，痔的静脉曲张学说逐渐失去其主导地位。另外，多项研究也证明门静脉高压与痔无直接关系。关于痔本质的另一学说起自18，19世纪，当时有学者认为肛管齿线上方局部增厚的黏膜下层具有类似海绵体勃起样能力。1962年Staubesand等在这些增厚的肛垫粘膜下层中发现含量丰富的动静脉吻合，并称之为“直肠肛门海绵体肌”。该结构得到了Schmidt与Thomson的证实。Stelzner等提出痔是“直肠肛门海绵体肌”内血管增生导致局部黏膜及黏膜下层增大，脱出的结果，即痔的血管增生学说。但这一学说直到近来才有研究证实痔组织中血管生长因子VEGF表达和微血管密度均较对照组高。因此，血管增生与痔发生的关系也未完全弄清。1975年，在Gass和Adams有关痔组织结缔组织病变的研究基础上，Thomson提出了痔的肛垫下移学说，指出肛垫是在胚胎期就已经存在的正常结构，痔是其病理性肥大并移位的结果。该学说认为肛垫中的平滑肌纤维与结缔组织随着年龄增长或在异常排便习惯等诱因长期作用下，出现退变而失去固定作用，肛垫不能抵抗排便时产生的向下推挤力量，最终下移脱出成为痔。该学说可以解释临床上痔的好发部位，更好地理解Ⅲ，Ⅳ度痔病患者的临床表现，但是临床上痔常以出血为早期表现而非脱出，而且研究发现痔切除术后患者肛门失禁的发生率并没有升高，这些结果提示肛垫下移学说尚不能成为对痔本质的最终定论。另外，肛管压升高，内外扩约肌功能异常，以及其他全身性因素都被认为与痔的发生有关综上所述，既往的理论都未能全部解释痔临床表现，因此这对痔病的预防和治疗都带来了困难。目前，有关痔发病机制及病理学的文献还很有限，其基础研究也很少。因此，在这方面的研究大有必要，对痔病发生的本质还需进行更深入的探讨。 研究目的 1．观察痔病患者肛管齿线上方组织中平滑肌纤维的形态结构和分布。 2．观察痔病患者肛管齿线上方组织中Ⅲ胶原纤维的分布情况。 3．观察和比较内痔组织与对照组中血管形态学改变及微血管密度(MVD)情况。 实验方法 一、实验材料和方法1.1实验标本选取与分组标本筛选自中山大学附属第二医院胃肠胰外科行痔上黏膜环切术的术后标本，共21例，其中男性9例，女性12例(平均年龄40.28±11.40岁)，所有患者按照中华医学会外科学分会肛肠外科学组《痔临床诊治指南》(2006)，诊断为Ⅲ-Ⅳ度，病程5.86±4.76年，并排除Crons病，肛瘘，肿瘤等其他肛肠良恶性疾病，既往无糖尿病，结缔组织疾病等慢性病史。所有患者术前无痔手术史及硬化剂注射史。 切除标本要求： ①荷包缝合在齿线上方约2.5-3.0cm②切除标本宽度约2.0cm，为完整环形，不含有痔组织，将其纵行剪开，取宽为1cm组织，并等分为三截，取其两端分别命名为痔上近端组织和痔上远端组织。 7例对照肛管组织标本源自因直肠癌而行直肠切除术的术后标本，取材部位在齿线上约2cm，并经病理证实为癌旁正常组织。其中男性6例，女性1例。患者平均年龄(34.57±12.77岁)。患者肿瘤位于齿线上6cm以上，且肿瘤浸润范围<1/3肠管，所有患者既往无痔病及其他良性肛肠疾病，无全身结缔组织疾病，术前无化疗及放疗史。对照组与痔病患者组在年龄构成上无统计学差异。所有患者均被告知本实验内容与风险并同意使用其术后标本进行研究。 1．3 HE染色操作步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，苏木素染色5分钟，自来水冲洗，盐酸酒精分化10秒，自来水浸泡10分钟，置伊红溶液中1分钟，常规脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片。 1.4 Masson三色染色操作步骤64℃烤片20分钟后，常规脱蜡至水，蒸馏水洗3次×3分钟，将切片置入Bouin溶液过夜后，自来水流水冲洗至切片黄色消失，Gill苏木素溶液染色10分钟后，直接入1﹪盐酸酒精分化2秒，流水冲洗10分钟，返蓝，丽春红酸性品红溶液浸泡7分钟，蒸馏水冲洗，1﹪磷钼酸溶液染色2分钟后，勿水洗，直接将切片置入苯胺蓝溶液染色5分钟，1﹪醋酸分色1分钟，蒸馏水冲洗后常规脱水透明，中性树脂胶封片后光镜下观察。 1.5 Ⅲ型胶原及血管内皮(CD34)免疫组化染色步骤： 本实验中切片采用Elivision两步免疫组化法进行染色。免疫组化试剂分别购自福建迈新生物技术有限公司及武汉博士德生物工程有限公司。 ①Ⅲ型胶原免疫组化染色方法：64℃烤箱烤片2小时后，常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲溶液(PBS，PH=7.4)洗片三次×3分钟；胃蛋白酶37℃孵育15分钟，PBS洗2次×3分钟，每张切片滴加50μl 3﹪H<,2>O<,2>-甲醇溶液，室温下孵育10分钟，PBS洗3次×3分钟，每一切片加50μl的抗Ⅲ型胶原纤维第一抗体(抗体稀释比例1：100)，4℃下孵育过夜；另取切片加50μl的抗CD34即用型第一抗体，室温下孵育1小时。PBS洗3次×5分钟，每张切片加50μ1聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20分钟。PBS洗3次×3分钟，每张切片50 μl的酶标抗兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30分钟。PBS洗3次×3分钟，每张切片加50μl DAB液，显色5分钟，自来水冲洗，苏木素复染，0.1﹪盐酸酒精分化，自来水冲洗后PBS返蓝，常规脱水透明后中性树脂胶封片。②血管内皮(CD34)免疫组化方法：64℃烤箱烤片2小时后，常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲溶液(PBS，PH=7.4)洗片三次×3分钟；将盛有柠檬酸盐的缓冲液(PH=6.0)的容器置入微波炉以高火加热至沸后，将切片放入，并改为低火持续微波加热16分钟，室温冷却20分钟，PBS洗3次×3分钟，加50μl的抗CD34即用型第一抗体，室温下孵育1小时。余后步骤同Ⅲ胶原免疫组化方法。 免疫组化质量控制： PBS代替一抗作阴性对照，剔除脱片及背景过高的切片。 1.6黏膜肌层平滑肌纤维病变分析根据Hancock等方法并加以改进，在低倍视野下(100×)将黏膜肌层平滑肌纤维的形态分为：无病理改变：肌纤维完整，走行一致，结构紧密轻度病理改变：部分肌纤维断裂，结构较疏松中度病理改变：肌纤维断裂，松散情况较严重，但仍有部分结构保持正常重度病理改变：肌纤维分散，消失，断裂严重，无正常走行方向1.7血管内皮CD34免疫组化染色结果判定与微血管密度MVD计数方法任何被抗CD34抗体染成棕黄色孤立的血管内皮细胞或内皮细胞丛，只要与临近微血管、细胞或其他结缔组织分开，就将其作为一个微血管计数(大于8个红细胞直径或有丰富肌层的不计在内)。按照Weidner等方法并加以改进，先在低倍视野内(100×)找到组织内微血管密度最高的区域，然后在200×视野下计数4个视野内微血管的，取其平均值为该切片的微血管密度(MVD)数目。二、统计学处理平滑肌病变相关的等级资料采用Kruskal-Wallis检验；痔上近远端组织间微血管密度的差异采用配对设计资料的t-检验分析；对照组与痔上近远端组间微血管密度的差异采用两独立样本均数的t检验分析；P<0.05为差异具有统计学意义。t-检验采用SPSS13.0版本统计软件包处理，Kruskal-Wallis检验采用STATISTICA FOR WINDOWS 5.0统计软件包处理。 结果 一、痔病患者肛管齿线上组织平滑肌形态学观察光镜下，平滑肌纤维分布于黏膜肌层与内括约肌层及血管管壁。 二，痔病患者肛管齿线上组织中Ⅲ型胶原纤维病理学改变免疫组化染色见Ⅲ型胶原纤维呈棕色阳性染色，纤维细，广泛分布于黏膜肌层，黏膜下层及血管壁内外膜。在痔病患者齿线上黏膜肌层中可见Ⅲ型胶原增生并取代平滑肌纤维。 三，肛管齿线上方组织血管形态及微血管密度(MvD)计数： 光镜下，痔病患者肛管齿线上组织及对照组织中HE染色下可见较多静脉，动脉及动静脉吻合。其中静脉管腔扩大，部分管壁较薄或无明显肌层，仅见内皮细胞与外膜紧贴相连，其管腔形态不规则，部分塌陷闭塞。 结论 1 本研究发现痔病患者肛管齿线上肠壁组织中黏膜肌层的平滑肌纤维断裂，变性，缺失，其程度与组织到痔核的距离有关，越靠近痔核端，平滑肌病变越严重，因此痔病的病理改变范围超过了痔核的本身。 2 本研究发现痔病患者肛管齿线上组织中Ⅲ型胶原纤维增生，并取代黏膜肌层及血管管壁肌层的平滑肌纤维，引起肛垫支持系统的病变与血管弹性的降低。 3 本研究发现痔病患者肛管齿线上组织中富含正常的扩张血管，部分血管管壁肌层断裂，消失并存在血管增生。