目的：有研究表明在食管癌患者中，DNA损伤修复能力下降，DNA脆性增加，癌组织细胞中有许多染色体明显改变，可以设想在食管癌发生发展过程中可能伴有DNA损伤的积累。Polβ是DNA polymerase家族的一员，广泛分布于哺乳动物细胞内。其主要功能是DNA错配修复(MMR)。其基因组DNA序列及互补DNA(cDNA)序列已有报导，且有报道在结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌中发现polβ基因的突变，其中结直肠癌患者中突变频率高达70～80％。 本室经两年的研究在世界上首次发现在食管癌高发区及非高发区食管癌患者的食管癌标本中也发现有该基因的突变，且其突变形式与已报道的在其他肿瘤中polβ的突变形式不尽相同。作为该课题的后继研究，本实验将扩大标本例数对取自上食管癌高发区人群中食管癌病例的手术标本中polβ的突变情况继续进行研究，以彻底明确该基因在食管癌中突变的情况；并在此基础上选择有代表意义的突变类型郑州大学ZXE年聊卜毕业论义 州为办DNA＄合酶日基因夹变及真检 载体的构注构建成真核表达载体，以期继续对其功能进行研究，或以上述成果为依托进行以卯 P为工具的基因治疗方面的尝试。 材料、方法：六月龄流产胎儿由郑州大学第一附属医院妇产科和郑州市妇幼保健院妇产科协助采集（水囊引产）；食管癌手术标本在河南省林什怖肿瘤医院收集食管癌手术标本20例（编号为 EOI卫O20），及癌旁标本（编号 EEI－EE20）均经病理检查诊断为鳞状上皮细胞浸润癌。实验中使用的试剂、质粒载体、菌种除本室保存外，均购于国内外各公司。提取总RN A：反转录合成＊DN A；巢式＊＊R扩增；用SSCP筛选突变基因序列；以一对全基因引物扩增在SSCP中被发现的异常标本的卯日完整DNA序列；选择pUCIS为载体，以 TpNA连接酶连接目的基因叫 p和质粒DNA；选用JM 09为宿主菌，用氯化钙共沉淀法制备感受态细胞并将重组体转入宿主菌。在用插入灭活法、蓝白筛选、小量质粒提取后限制性内切酶切割以及通用引物扩增等方法鉴定重组体：最后通过大量质粒提取测定 ＊＊A序列测得序列用DNASIS、OMIGA软件与GenBank中查到的DNA聚合酶p基因序列进行同源性比较分析，推测其蛋白序列并分析蚤白同源性及结构改变情况。第二步，选择点型突变病例，扩增提取含该片段及含野牛型pci6片段的pUC18下的重组质粒及 pcDNA3质粒，用 BamH、Hindlll酶切，以郑州大学3XE＜卜硕士毕业论文 食管癌IhA聚合酶巳基因突变及真核表达载体的构迷TpNA连接酶连接目的基因卯叩和双粘质粒，用氯化钙共沉淀法制备感受态细胞并将重组体转入宿主菌，小提质粒酶切、通用引物扩增鉴定；选取同上的病例及胎儿食管上皮标本提取总 NA反转录生成 CDNA．以 VP、PPZ扩增，同时扩增并提取VR1012质粒，与 PClt产物同以 BamH酶切，纯化后同前述方法连接、转化、鉴定。但其重组质粒需小量提取后以 ggl 11不对称酶切进行正反鉴定。结果：本研究结果显示，在两例胎儿食管组织中pci6无突变。手术病例组20例食管癌癌组织中存在叫p基因变异的有 9例，突变率为 45o①／20）。从” D基因变异位点分析，在”p基因的454＊66区段集中了H个点突变，在648－670区段集中了四个点突变，那么这两个区段有可能是食管癌中卯D的热点区域。pci P基因58hp的大片段缺夫，在所有发生突变的标本中出现4次，其出现频率高达44％ N旧），这一缺失突变形式也有可能是” D在食管癌中的热点突变形式。从氨基酸水平分析，462位G—T突变引起氨基酸门 7位出现终止码；核酸门 位到 234位缺失，造成从22位氨基酸开始移码突变，到26位出现终止码。这些突变可造成… D的蛋白质结构不完整，使其叫 p的 DNA修复生物活性完全丧夫，结合病例的病理报告分析，显示包含有这两个突变形式的病例，其癌细胞恶性化程度更高。另外刀州、I人学兀m年帧上毕业沦文 食管娥DNA聚合酶p基囚突变及真核表达载体的构注665位 T－C、737位A～T和 740位A—G均为改变对应的氨基酸编码，并且这三个改变均是对应位氨基酸密码于的最后一个碱基，推测它应该属于SNP（单核昔酸多态性卜 构建成功含58hp大片段缺失、648ntG—C、665niT—C点突变及野生型 pci6 CDNA片段，分别以 PCDNA3、VR1012为载体的两套高表达真核载体。结论：1．进一步证实了pci6在食管癌发病中的作用，扩展了食管癌发病机理；多种类型的突变形式均导致氨基酸序列、二级。空间结构的改变从而导致酶活性的变异。2．真核表达载体构建成功，可以此为工具进一步深入探讨pci6基因突变及功能突变与环境、遗传因素的关系；寻找稳定pci6的生物调节剂（中药、生物制品等），推广高发区人群预防及食管癌的基因预防和基因治疗的机制和途径。