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目的:1、建立新生大鼠高氧性肺损伤的模型;2、观察高氧性肺损伤急性期肺组织中P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)的磷酸化与基质金属蛋白酶-2,9(matrix metalloproteinases,MMP-2,9)及其特异性组织抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)mRNA的表达水平的变化;3、探讨P38-MAPK的磷酸化对髙氧肺损伤急性期炎症反应及MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达的影响。方法:1、实验动物分组及动物模型的建立:72只3～5天的新生Sprague Dawley(SD)大鼠随机分成3组:Ⅰ空气组;Ⅱ高氧+生理盐水(高氧组) ;Ⅲ高氧+SB203580 (干预组),各24只。再按实验时间点3,7天分二个亚组12只;每个亚组分灌洗组和非灌洗组,各6只。将Ⅱ、Ⅲ组放于氧箱中,保持箱内氧气浓度为90%～95%,Ⅰ组置于空气中;Ⅲ组每日同一时间点尾静脉注射SB203580(P38-MAPK特异性磷酸化抑制剂,美国Sigma公司,0. 5 mg/kg);Ⅱ组尾静脉注射等量的生理盐水。2、标本采集:每组分为①肺泡灌洗组和②非肺泡灌洗组两个亚组。灌洗组在各时间点分别麻醉动物后以生理盐水行支气管肺泡灌洗,留取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)测定BALF中白细胞计数;非灌洗组各时间点处死动物,取部分右肺制作肺组织匀浆,检测磷酸化P38 MAPK,MMP-2、MM P-9、TIMP-1 mRNA,肺组织匀浆总蛋白;余下右肺组织称量后置于烤箱中测肺湿/干重比。左肺固定、包埋、切片,用于常规HE染色,观察肺组织病理学变化,拍照存档;3、肺组织磷酸化P38 MAPK(p-P38 MAPK)检测(Western blot法):采用改良RIPA缓冲液常规提取肺组织中蛋白质,BCA比色法(Bio-Rad蛋白定量检测试剂盒)测定所提取蛋白的浓度。各组蛋白取样100μg进行SDS- PAGE电泳,电转移至PVDF膜。以封闭缓冲液室温封闭1 h,phospho-P38 MAPK一抗(1∶1000,购自美国SANTA CRUZ公司) 4℃孵育过夜,二抗(1∶2000)孵育1 h,ECL显色。用Q550CW计算机图像分析系统对蛋白条带进行分析处理,蛋白含量用目的条带校正容积(Adj volume) /GAPDH校正容积(Adj volume)表示。4、肺组织MMP-2、MM P-9、TIMP-1 mRNA检测(RT-PCR法):(1)按TRIZOL总RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)说明书操作。用RNA提取液( TRIZOL Reagent )从肺组织中提取总RNA。(2)逆转录合成互补DNA ( cDNA)第一链。(3) PCR扩增(引物及扩增条件详见实验步骤)。(4)产物分析:扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,用Q550CW计算机图像分析系统进行电泳条带分析。目标产物mRNA表达水平以目的条带校正容积(Adj volume) /GAPDH校正容积(Adj volume)表示。结果:1.一般状况:空气组大鼠精神状态佳、活动灵活,实验期间体重增长稳定;高氧组大鼠3天后精神反应差,7天后体重增长不明显,呼吸急促,活动迟缓;SB203580干预组大鼠精神状态稍差、活动稍减少、体重增长不明显,呼吸稍急促。2.肺组织病理切片:高氧组3天时肺泡腔内有明显出血和炎性细胞渗出,7天时损伤加重,肺间隔增宽,肺组织结构紊乱。SB203580干预组与高氧组比较炎症改变减轻,肺间隔增宽不明显。3.肺湿/干重比(W/D):实验3天,高氧组较空气组增高(5.5104±0.5001 vs 4.2706±0.3884,p<0.01);实验7天,该比值进一步升高(5.7671±0.3599 vs 4.3977±0.2313,p<0.01)。SB203580干预组与高氧组比较,相同时间点该比值明显降低(实验3天,4.7411±0.3112 vs 5.5104±0.5001,p<0.05;实验7天,4.6761±0.2504 vs 5.7671±0.3599,p<0.01)。4.肺组织匀浆总蛋白(Total Protein,TP)含量检测:实验3天,高氧组TP含量已高于空气组(1.0463±0.2113 vs 0.7323±0.0297,p<0.05);7天时,高氧组TP含量持续增高(1.2226±0.1751 vs 0.9416±0.1365,p<0.05);SB203580干预组与高氧组比较,实验3天时TP含量无显著差异(1.0262±0.1281 vs 1.0463±0.2113, p>0.05),7天时明显下降(0.9297±0.0642 vs 1.2226±0.1751,p<0.05)。5. BALF中白细胞计数:实验3天,高氧组BALF中白细胞计数显著高于空气对照组,差异有统计学意义(42.32±4.78 vs 11.73±3.86,p<0.01);实验7天,白细胞计数进一步增加(126.48±18.88 vs 18.75±3.74,p<0.01)。SB203580干预组与高氧组比较,相同时间点白细胞计数显著下降(实验3天,21.35±3.21 vs 42.32±4.78, p<0.01;实验7天,33.75±8.63 vs 126.48±18.88,p<0.01)。6.肺组织磷酸化P38 MAPK(p-P38 MAPK)表达:空气组肺组织p-P38 MAPK仅有较弱的表达。实验3天,高氧组p-P38 MAPK表达明显增强,与相应时间点空气组比较,差异有统计学意义(1.506±0.160 vs 0.627±0.024,p<0.01);实验7天,p-P38 MAPK表达进一步增强(1.998±0.176 vs 0.664±0.034,p<0.01)。SB203580干预组与高氧组比较,相同时间点p-P38 MAPK表达明显减弱,差异有统计学意义(实验3天,0.936±0.051 vs 1.506±0.160,p<0.01;实验7天,1.319±0.082 vs 1.998±0.176,p<0.01)。7.肺组织MMP-2、MMP -9、TIMP-1 mRNA的表达:空气组MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达水平低。高氧组MMP-2(实验3天,3.428±0.316 vs1.681±0.092,升高103%,p<0.01;实验7天,1.149±0.129 vs 0.490±0.034,升高134%,p<0.01)、MMP-9(实验3天,0.383±0.011 vs 0.133±0.006,升高190%,p<0.01;实验7天0.329±0.008 vs 0.142±0.008,升高132%,p<0.01)、TIMP-1 mRNA(实验3天, 0.294±0.015 vs 0.112±0.010,升高54%,p<0.05;实验7天,0.449±0.009 vs 0.155±0.006,升高40%,p<0.05)表达明显增强,与相同时间点空气组比较,差异有统计学意义,且MMP-2、MMP-9 mRNA升高幅度较TIMP-1 mRNA升高幅度大; SB203580干预组与髙氧组比较,相同时间点MMP-2(实验3天,2.104±0.094vs3.428±0.316,降低39%,p<0.01;实验7天0.620±0.027vs 1.149±0.129,降低46%,p<0.01)、MMP-9(实验3天,0.208±0.012vs 0.383±0.011,降低46%,p<0.01;实验7天, 0.198±0.0112 vs 0.329±0.008,降低57%,p<0.01)、TIMP-1 (实验3天,0.197±0.013 vs 0.294±0.015,降低18%,p<0.05;实验7天,0.273±0.018 vs 0.449±0.009,降低14%, p<0.05)mRNA表达减弱,差异有统计学意义,且MMP-2、MMP-9 mRNA降低幅度较TIMP-1 mRNA降低幅度大。结论:1.长期的高浓度吸氧可导致新生大鼠的急性肺损伤,病理表现为肺组织局部充血和出血、炎症渗出、肺间隔断裂、肺泡腔扩大和肺结构组织紊乱;2. p-P38 MAPK在新生大鼠急性高氧性肺损伤的肺组织中表达水平明显升高,且随肺损伤程度的加重而进一步升高,提示P38 MAPK信号传导通路的激活可能参与了高氧肺损伤发病过程中的调控;3.高氧肺损伤时肺组织中MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达明显上调,并且MMP-2、MMP-9/TIMP-1的平衡被改变,表明基质金属蛋白酶(MMPs)的过度表达及与基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂(TIMPs)表达之间的失衡在高氧肺损伤的发展及转归中发挥重要的作用;4. P38 MAPK特异性磷酸化抑制剂SB203580通过抑制P38 MAPK的磷酸化,可减轻高氧肺损伤急性期的炎症反应,同时影响MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达,提示P38 MAPK信号传导通路的激活可能参与了高氧肺损伤急性期炎症反应和MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA的表达的调控,为新生儿髙氧肺损伤的防治提供了新途径。