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背景:结核病致病菌是结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis简称MTB)，自卡介苗(BCG)及一线、二线抗结核化疗药物问世，结核病患病率得到了控制。但近年来随着HIV合并感染、耐多药结核病出现及结核病临床表现不明显等使结核病诊断和治疗面临严重挑战。我国结核病患病人数居世界第二位，迫切需要提高和改进结核病的预防、诊断和治疗。
目的:建立K6为刺激抗原的IFN-γELISPOT法，评价该法用于结核病辅助诊断的价值。
方法:(1)前瞻性纳入新入院高度怀疑、未化疗的结核病患者，包括肺结核和结核性胸膜炎患者。剔除经临床和实验室综合诊断为非结核病患者。56例非结核性肺部疾病患者经过临床诊断为肺炎和病理确诊为肺癌。新入伍新兵作为健康者。结核病患者、非结核性肺部疾病患者和体检的健康者抽取肝素抗凝外周血4ml，梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，体外K6刺激PBMCs于37℃、5％CO2培养20～24h。细胞刺激培养结束后按试剂盒说明书进行显色，酶联免疫斑点仪分析斑点形成细胞数。T-SPOT-TB用于结核病辅助诊断按操作说明书进行。(2)冻干BCG、培养BCG、热灭活MTB、抗原K6免疫小鼠，以生理盐水作为阴性对照，4周后解剖小鼠取脾脏研磨，梯度离心法分离脾淋巴细胞、刺激培养、斑点显色、斑点形成细胞计数。(3)健康者采用孟都法进行BCG-纯化蛋白衍生物(PPD)皮试，72小时后测硬结横、纵直径(mm)。(4)数据采用平均值±标准差表示，两个百分率比较采用卡方检验(x2)，比较两组平均值采用t检验，比较三组及以上平均值采用一元方差分析，两种方法检测一致性采用Kappa检验。统计分析采用SPSS16.0软件。散点图和柱形图采用Graphpadprism5软件制作。
结果:(1)K6刺激浓度为5μg/ml。该浓度建立的K6IFN-γELISPOT用于结核病辅助诊断，其敏感度为80.0％(68/85)、特异度为83.9％(47/56，对非结核性肺部相关疾病患者)和91.4％(106/116，对健康人)。结核病患者和非结核性肺部疾病患者T-SPOT-TB检测敏感度为85.8％(73/85)、特异度为73.2％(41/56)。K6IFN-γELISPOT和T-SPOT-TB敏感度和特异度比较差异无统计学意义(p＞0.05)，两种方法诊断一致性较高:对结核病患者，诊断一致性为91.8％(Kappa=0.71);对非结核性肺部疾病患者，诊断一致性为89.3％(Kappa=0.68)。(2)健康人BCG-PPD特异度为31.9％(临界值大于等于5mm)，TST特异度极显著低于K6IFN-γELISPOT(x2=19.451，p＜0.01)。PPD直径大于等于15mm的健康者K6IFN-γELISPOT特异度显著低于PPD皮试阴性健康者。BCG卡痕组与无BCG卡痕组K6IFN-γELISPOT特异度比较差异不显著(x2=0.296，p＞0.05)。(3)BCG和热灭活结核杆菌免疫小鼠的脾细胞对K6IFN-γELISPOT呈阴性反应。K6与弗式不完全佐剂免疫小鼠，30.0％和40.0％小鼠脾细胞对抗原A和K6IFN-γELISPOT呈阳性反应，但所有小鼠脾细胞对抗原BELISPOT均呈阴性反应。
结论:K6IFN-γELISPOT检测敏感度与特异度与T-SPOT-TB相当，K6IFN-γELISPOT不受BCG接种影响且可能用于活动性结核病诊断。这提示我们将进一步评价K6IFN-γELISPOT用于活动性结核病诊断价值。