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研究背景： 随着年龄的增长，女性体内的卵泡会逐渐减少，到进入绝经期时只剩下不到1000个卵母细胞(BAKER,T G,1963)。另外，随着年龄增长，卵母细胞的非整倍体率也逐渐增加。因此，女性一生中可利用的正常卵母细胞数量是有限的。如何保存女性的生育能力已成为生殖医学领域一个亟待解决的科学问题。而卵母细胞冷冻技术，作为保存女性生育能力的有效手段，在辅助生殖领域中扮演着越来越重要的角色。随着玻璃化冷冻技术的发展，卵母细胞冷冻已获得了几乎与新鲜卵母细胞相同的胚胎种植率和临床妊娠率，但大部分数据显示，其卵母细胞卵裂率、优胚率仍难以达到新鲜卵母细胞的水平。关于卵母细胞冷冻损伤的具体机制目前仍不十分清楚，但有研究指出，冻融会造成卵母细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平的异常增加(Gupta,M K,Uhm,S J and Lee,H T,2010)，而ROS的异常积累会造成细胞内氧化应激，并进一步对卵母细胞的纺锤体、线粒体、DNA等亚细胞结构造成损伤(Ou,X H,Li,S and Wang,Z B,et al.,2012)。因此，本研究试图通过减少冻融卵母细胞内的ROS水平来减少上述冷冻损伤。而白藜芦醇（Resveratrol,RSVL）是一种天然的植物抗毒素，已有大量研究证实其能降低细胞内过多的ROS，具有抗炎症、抗肿瘤、抗病毒等多种作用(Liu,M,Yin,Y and Ye,X,et al.,2013;Baur,J A and Sinclair,D A,2006;Yang,T,Wang,L and Zhu,M,et al.,2015)，其对冷冻复苏的卵母细胞是否有保护作用至今罕有报道。因此，本文旨在研究玻璃化冷冻对成熟卵母细胞纺锤体染色体、线粒体、DNA、ROS等的影响，并且通过在冻融卵母细胞的复苏培养液中添加RSVL,试图减轻玻璃化冷冻对卵母细胞造成的不良影响，为人类卵母细胞玻璃化冷冻技术的成功提供一个新策略。 第一部分 小鼠成熟卵母细胞的玻璃化冷冻损伤和白藜芦醇的保护作用 研究目的： 研究玻璃化冻融对卵母细胞纺锤体及染色体、线粒体、DNA、ROS等的影响，并且通过在冻融卵母细胞的复苏培养液中添加RSVL,试图减轻玻璃化冷冻对卵母细胞造成的不良影响。 研究方法： 将获得的所有小鼠成熟卵母细胞分为四组：1)新鲜(对照组);2)冷冻解冻(F0h组);3)冻融后于普通复苏液中培养3小时(F3组);4)冻融后于RSVL复苏液中培养3小时(F3h+RSVL组)。比较这四组卵母细胞的纺锤体染色体形态、线粒体膜电位（△Ψm）、线粒体分布、DNA双链断裂（DSBs）和ROS水平。 研究结果： 1.本研究共获得了2230个成熟小鼠卵母细胞，有1698个成熟卵母细胞进行了玻璃化冷冻解冻，其中有1469个存活，总的复苏存活率为86.5%。 2.卵母细胞的正常纺锤体染色体比例分别为：新鲜对照组86.3±4.7%；F0h组48.2±7.5%；F3h组71.0±4.4%；F3h+RSVL组84.2±4.6%。经过玻璃化冻融后，卵母细胞的纺锤体染色体正常的比例明显下降（p＜0.05)；经过3小时的复苏培养后明显恢复（p＜0.05），但仍比新鲜对照组低（p＜0.05)；而在复苏培养液中添加RSVL后较不添加组明显增加（p＜0.05)。 3.卵母细胞的△Ψm分别为：新鲜对照组1.19±0.10；F0h组0.73±0.04；F3h组0.90±0.06；F3h+RSVL组1.17±0.08。经过玻璃化冻融后，卵母细胞△Ψm明显下降（p＜0.05)；经过3小时的复苏培养后有所恢复（p＜0.05），但仍比新鲜对照组低（p＜0.05)；而在复苏培养液中添加RSVL后较不添加组明显增加（p＜0.05)。 4.卵母细胞的线粒体极化分布比例分别为：新鲜对照组52.0±4.4%；F0h组13.5±2.3%；F3h组12.4±1.8%；F3h+RSVL组12.1±3.0%；均质分布比例分别为：新鲜对照组44.5±4.8%；F0h组42.1±1.5%；F3h组24.3±2.9%；F3h+RSVL组26.5±3.7%；而异常的成团分布比例分别为：新鲜对照组3.4±1.6%；F0h组44.4±3.8%；F3h组63.4±1.1；F3h+RSVL组61.5±5.1%。经过玻璃化冻融后，卵母细胞正常的极化分布明显减少，而异常的成团分布明显增加（p＜0.05）；经过3小时的复苏培养，其成团分布模式进一步增加（p＜0.05）；而在复苏培养液中添加RSVL并不能阻止这种改变（p＞0.05）。 5.卵母细胞存在DNA DSBs的比例分别为：新鲜对照组24.5±3.5%；F0h组26.9±0.6%；F3h组42.0±2.8%；F3h+RSVL组22.1±2.8%。经过玻璃化冻融后，卵母细胞DSBs的比例并没有增加（p＞0.05）；但是经过3小时的复苏培养后明显增加（p＜0.05）；而在复苏培养液中添加RSVL后，其DSBs比例较不添加组明显减少（p＜0.05)。 6.卵母细胞的ROS相对荧光强度分别为：新鲜对照组1.00±0.00；F0h组1.37±0.13；F3h组1.66±0.08；F3h+RSVL组1.10±0.02%。经过玻璃化冻融后，卵母细胞的ROS水平较新鲜组明显增加（p＜0.05)；经过3小时的复苏培养后进一步增加（p＜0.05）；而在复苏培养液中添加RSVL后，其ROS水平较不添加组明显降低（p＜0.05)。 研究结论： 1.玻璃化冻融后，卵母细胞的纺锤体染色体正常比例明显下降；经过3小时的复苏培养后明显增加，但仍比新鲜对照组低。 2.玻璃化冻融后，卵母细胞的△Ψm明显下降；经过3小时的复苏培养后明显恢复，但恢复不完全。 3.玻璃化冻融后，卵母细胞的线粒体极化分布明显减少，异常的成团分布模式明显增加；经过3小时的复苏培养后，其成团分布模式进一步增加；而添加RSVL并不能阻止这种改变。 4.玻璃化冻融后，卵母细胞DSBs的比例并没有马上增加；但是经过3小时的复苏培养后，存在DSBs的卵母细胞明显增加。 5.玻璃化冻融后，卵母细胞内的ROS水平明显增加，经过3小时的复苏培养后进一步增加。 6.RSVL作为一种强抗氧化剂，能有效降低小鼠冻融卵母细胞的ROS水平，并对冷冻造成的纺锤体染色体、线粒体功能、DNA DSBs等损伤具有保护作用。 第二部分 白藜芦醇对人卵母细胞玻璃化冷冻后线粒体膜电位的影响 研究目的： 通过在解冻复苏液中添加RSVL，探讨其对人类冻融后卵母细胞的△Ψm的恢复是否有积极作用。 研究方法： 收集正在进行IVF-ET病人的不受精卵母细胞进行玻璃化冷冻，将每个病人冻融后存活的成熟卵母细胞平均分为两组：1)冻融后于普通复苏液中培养3小时(hF3组);2)冻融后于RSVL复苏液中培养3小时(hF3h+RSVL组)。使用JC-1进行染色并在激光共聚焦显微镜下检测两组卵母细胞的△Ψm。 研究结果： 1.本研究共收集了60枚来自正在进行IVF-ET治疗的5个病人的不受精卵母细胞.这60枚卵母细胞都进行了玻璃化冷冻解冻，其中有56枚存活，存活率为93.5%。 2.两组卵母细胞的△Ψm分别为：hF3h组：2.04±0.78；hF3h+RSVL组:2.92±0.88。在复苏培养液中添加RSVL后，人类冻融后卵母细胞的△Ψm较不添加组明显增加（p＜0.05)。 研究结论： 在复苏培养液中添加RSVL明显有助于改善人类冻融后卵母细胞的线粒体功能，这与在小鼠卵母细胞中得到的结论一致。