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在多种疾病,例如,动脉粥样化损伤,癌症,败血症等中,组织因子(TF)扮演了很重要的角色,其介导的凝血及血栓形成导致疾病的发展及患者的死亡。而组织因子途径抑制因子(TFPI)作为组织因子的主要抑制因子,对血栓形成、感染性休克、血管再狭窄、内毒素血症和DIC等具有明显防治作用。因此,重组TFPI的研制具有很好的临床应用价值。目前的表达系统,例如,哺乳动物细胞、酿酒酵母及大肠杆菌由于成本,表达量等原因,在TFPI重组蛋白表达方面还存在一定欠缺。本论文应用巴斯德毕赤酵母表达系统表达TFPI,以期获得表达量更高的TFPI重组蛋白表达系统。
本研究应用G418筛选出含有高拷贝TFPI cDNA的巴斯德毕赤酵母菌株GS115—rhTFPI-PPIC9K anti—G4184.0mg/ml,使重组TFPI表达量从0.211±0.023mg/L提高到了1.255±0.223mg/L。建立了采用发酵罐高密度培养重组酵母菌的实验室方法,使重组TFPI表达量提高了约5.45倍,达到6.838±0.16mg/L。探索了培养温度和甲醇浓度对重组蛋白表达的影响,通过对培养温度及甲醇浓度的优化,使重组TFPI表达量最高达到了9.951±0.782mg/L,活性达到3.91±1.37U/ml。
本研究的开展,为TFPI蛋白功能研究及在相关疾病防治中的应用提供了坚实的实验室基础。