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亚洲沙尘颗粒物(Asian sand dust，ASD)常见于春季。当我国北方和蒙古国发生沙尘暴时，产生的ASD能够扩散到大片地区，包括我国东部，朝鲜半岛和日本，甚至会越过北太平洋到达美国。近年来，ASD由于对人群健康的不良影响而受到日益广泛的关注。有些报道还提示ASD事件与成人和儿童患者呼吸系统症状增加有关。 我们以前的研究表明ASD可以加剧卵蛋白(ovalbumin，OVA)诱导的肺嗜酸性粒细胞增多症，而将ASD在360℃加热使有毒物质灭活后得到的经加热的ASD(heat-ASD，H-ASD)仅能导致轻微效应。在此基础上，我们推测，吸附于ASD的有机和无机物质可能在加剧肺嗜酸性粒细胞增多症中起着一定作用。在ASD的长途转运过程中，微生物和大气污染物，包括焦油(Tar)、硫酸盐和硝酸盐会吸附于其上。因此，为了探究ASD中的Tar和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）污染是否与ASD加剧肺嗜酸性粒细胞增多症明显相关，我们进行了本实验，观察了Tar和/或H-ASD对OVA诱导的肺嗜酸性粒细胞增多症的加剧作用;LPS和/或H-ASD对OVA诱导的肺嗜酸性粒细胞增多症的加剧作用。 实验方法: 1、样品处理 将从蒙古国南部沙漠采集的ASD样品在电子加热器中经过360℃加热处理30min，以除去吸附于颗粒物表面的微生物、硫酸盐和硝酸盐等成分，得到H-ASD。 将从日本北九州市采集的ASD用有机溶剂提取其中的Tar。 2、实验动物及染毒 从Charles River公司（神奈川，日本）购入雄性ICR和BALB/c小鼠，适应性喂养一周后开始实验。每间隔一周，将小鼠在4％三氟氯溴乙烷作用下麻醉，经气管注入不同剂量的Tar或LPS、H-ASD(0.1 mg/mouse)和/或OVA。最后一次染毒的第二天，经小鼠腹腔注射戊巴比妥，将其深度麻醉，放血处死。 3、实验动物的病理检测 取小鼠肺部固定于10％中性福尔马林缓冲液中，肺叶分离后，将其切割成2mm大小的碎块，用石蜡包埋，制作成3μm厚的切片。HE染色后观察呼吸道由近端向远端嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润情况。PAS染色后观察支气管上皮杯状细胞的增殖情况。 4、采集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)和血液 小鼠深度麻醉，心脏采血，离心分离血浆，-80℃深冻冰箱中保存，用于检测血浆中的OVA特异性抗体IgE和IgG1的表达;气管固定，用37℃无菌生理盐水灌洗小鼠肺部，收集灌洗液后离心取上清液，-80℃深冻冰箱中保存，用于检测BALF中细胞因子和趋化因子的蛋白表达。 5、BALF中的炎性细胞计数 将BALF离心后得到的沉淀溶于生理盐水中，制成细胞悬液，显微镜下应用血细胞计数器直接计数总细胞数。细胞悬液应用细胞离心涂片机制作细胞涂片，应用Diff-Quik染色，显微镜下观察计数嗜酸性粒细胞等炎性细胞。 6、BALF中的细胞因子和趋化因子的检测 应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒检测BALF中细胞因子和趋化因子的蛋白表达。其中细胞因子包括:白细胞介素(Interleukin，IL)-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-17A和干扰素(interferon，IFN)-γ、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、转化生长因子(Transforminggrowth factor, TGF)-β;趋化因子包括:角质细胞趋化因子(Keratinocytechemoattractant，KC)、巨噬细胞炎症蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1α、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP)-1、MCP-3、调节激活正常T细胞表达和分泌细胞因子(regulated on activation normal T cellexpressed and presumably secreted，RANTES)和嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)。 7、OVA特异性免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)E和IgG1抗体的检测 用ELISA试剂盒检测小鼠血浆中OVA特异性IgE和IgG1抗体的表达。 8、分离培养基因敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bone-marrowderived macrophages, BMDMs) 分离培养来源于野生型(wildtype，WT)、Toll样受体(Toll like receptor, TLR)2基因敲除、TLR4基因敲除、髓样分化因子(myeloid differentiation factor88，MyD88)基因敲除小鼠的BMDMs，以PBS或LPS孵育12h，用Elisa法检测上清液中的IL-6、MCP-1、MIP-1α和TNF-α等细胞因子和趋化因子。 9、统计学分析 本研究应用SPSS Statistics Client21统计学软件进行分析，统计结果表述为平均数±标准误，采用单因素方差分析比较不同染毒组的实验数据;当组间差异具有统计学意义时，采用Tukey法进行组间比较，p＜0.05具有统计学意义。 实验结果: 1、OVA、H-ASD和Tar或LPS干预对小鼠BALF中细胞分布的影响 OVA单独作用没有增加这几种细胞中任何一种的数量，但是当它与Tar或LPS联合作用时，这几种细胞的数量都有轻度增加。而且当H-ASD+Tar或H-ASD+LPS与OVA联合作用时，这几种细胞的数量都明显增加了。 2、OVA、H-ASD和Tar或LPS干预对小鼠气道病理改变的影响 H-ASD+OVA+Tar和H-ASD+OVA+LPS导致了小鼠气道上皮中杯状细胞中度增殖，伴有气道粘膜下嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞中至重度浸润。 3、OVA、H-ASD和Tar或LPS干预对小鼠BALF中细胞因子和趋化因子表达的影响 与Control、OVA和单独干预组相比，H-ASD+ OVA+ Tar和H-ASD+ OVA+LPS升高了BALF中IL-5、IL-13、eotaxin和MCP-3的水平。 4、OVA、H-ASD和Tar或LPS干预对小鼠OVA-IgE和OVA-IgG1生成的影响 与Control、OVA和单独干预组相比，H-ASD+ OVA+ Tar和H-ASD+OVA+LPS促进了OVA-IgG1的生成;H-ASD+OVA+ LPS1还促进了OVA-IgE的生成。 5、细胞培养上清液中细胞因子和趋化因子的表达 LPS刺激TLR4基因敲除小鼠BMDMs，未能诱导TNF-α和IL-6的表达，但是LPS刺激TLR2基因敲除小鼠BMDMs，能诱导TNF-α和IL-6的表达。 结论: 本研究的结果证明，在OVA和H-ASD存在的条件下，ASD上所附着的Tar或LPS可加剧过敏性肺炎。而且LPS的这种作用可能是由TLR4依赖性的信号通路介导的。当前研究的结果提示暴露于含有Tar和LPS的ASD可能是成人和儿童哮喘的一个显著危险因素。