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随着人类基因组计划的完成,越来越多的研究开始关注基因多态性在医学方面的应用。要分析基因多态性,首先要得到DNA。口腔黏膜上皮细胞是分子流行病学、法医学和遗传学研究中重要的DNA来源。目前有多种方法可以用于口腔黏膜上皮细胞DNA的提取,各有其优缺点。还没有一种方法能满足安全、快速、简便、经济、可靠的要求。盐析法是全血基因组DNA提取常用的方法之一,具有简便快捷、经济安全、稳定可靠的特点。如果盐析法能用于口腔黏膜上皮细胞DNA的提取,可能会是一种较好的口腔黏膜上皮细胞DNA的提取方法。作为人类基因组中最常见的遗传变异,单核苷酸多态性与疾病的发生、发展、预后以及疾病治疗过程中药物的疗效和毒副作用之间的关系日益受到重视。对SNPs的准确分型有助于疾病的预防、早期诊断和治疗。虽然目前有很多SNPs的分型方法,但有的需要特殊的设备、有的需要昂贵的试剂、有的成本较高。如果能用普通PAGE直接对SNPs进行分型,可大大降低实验成本,提高效率。目的:1、建立一种安全、快速、简便、经济、可靠的口腔拭子DNA提取方法。2、建立一种能在普通实验室开展的准确、简便、快速、低成本、高通量的SNPs分型方法。3、应用建立的SNPs分型方法对临床样本进行分析。方法:1、以在本研究室做实验的志愿者提供的10支口腔拭子为例,用自己配制的试剂进行DNA提取。用细胞裂解液和蛋白酶K消化口腔上皮细胞,然后用5mol/L NaCl沉淀蛋白质,用异丙醇沉淀DNA,最后用70%乙醇洗涤得到的DNA并将其溶于TE中。用紫外分光光度计对得到的DNA进行浓度和纯度检测。以得到的DNA为模板,用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术对两个SNPs进行分型。对不同基因型的样本测序验证。2、用自己建立的盐析法快速提取口腔拭子DNA的方法,对130例志愿者提供的口腔拭子进行DNA提取。以2个方面来源的DNA为模板,对13个SNPs(MTHFR基因A1298C、CYP19A1基因rs10046和rs4646.CYP3A5基因A6986G、TP53基因rs1042522. NQO1基因C609T、GCKR基因rs780094、RGS4基因rs951436、CHRNA3基因rs12910984、MYOC基因-1081A/G和-998C/G、MDR1基因3489+59T>G和3489+80C>T)进行分析。对在SNPs附近有内切酶酶切位点的5个SNPs(TP53基因rs1042522、GCKR基因rs780094、NQO1基因rs1800566、MTHFR基因A1298C和CHRNA3基因的rs12910984)进行酶切分析。对可能影响SNPs分型的DNA片段自身因素、PCR扩增条件和电泳条件进行优化,建立普通聚丙烯酰胺凝胶电泳分析SNPs的方法。在检测条件优化的基础上,对13个SNPs进行检测。为了进行高通量检测,还进行了复合扩增和1块胶上分10层上样。对所有的SNPs进行测序验证。对聚丙烯酰胺凝胶电泳结果、酶切结果和测序结果进行比较。3、用建立的SNPs分型方法对104例使用5-FU为基础的化疗的晚期胃癌患者样品的3个SNPs位点(MTHFR基因A1298C、MDR1基因3489+59T>G和3489+80C>T)进行分析,并研究这3个位点多态性与化疗有效率之间的关系。结果:1、建立的盐析法提取口腔拭子DNA所需时间在1小时左右,提取单支口腔拭子DNA的全部费用不超过1.5元。单支口腔拭子得到的DNA量在0.68μg-2.56μg之间,OD260/OD280比值在1.77-1.94之间。经PCR扩增和酶切消化,10个样本的两个单核苷酸多态性都得到了清楚分型。酶切结果与测序结果吻合。2、5个SNPs的酶切都得到了清楚分型。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析SNPs的优化结果显示:GC含量和碱基组成对电泳的影响不大,而SNPs在片段中的位置和扩增片段长度可能是影响聚丙烯酰胺凝胶电泳对SNPs分型的重要因素。就PCR扩增来说,模板量、DNA聚合酶、退火温度、循环数都可能会影响聚丙烯酰胺凝胶电泳对SNPs的分型。把这种以构象不同为基础的对SNPs分型的方法称为构象差异凝胶电泳。对13个SNPs的分析显示有8个SNPs可以被直接分型,2个SNPs不能直接被分型,3个SNPs因样本量小不能确定。此外,在CHRNA3基因上还发现1个新的SNPs。10例样品NQO1基因C609T多态性PCR产物10层上样电泳图显示至少有7层可以清楚地区分3种基因型。4个SNPs的复合扩增也都得到了清楚的结果。DNA测序结果较好,证实了各扩增片段为目的片段。构象差异凝胶电泳结果和酶切、DNA测序结果完全一致,证明了构象差异凝胶电泳对SNPs分型的可靠性。与酶切相比,构象差异凝胶电泳对SNPs的分型不需要内切酶,因此成本较低。与单链构象多态性相比,由于构象差异凝胶电泳在PCR扩增后不需要对PCR产物进行变性,可以直接上样,因此较单链构象多态性成本更低、操作更简便。3、构象差异凝胶电泳上3个位点(MTHFR基因A1298C、MDR1基因3489+59T>G和3489+80C>T)的不同基因型都得到了清楚区分。3个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。104例患者的总有效率为41.3%。不同基因型与化疗有效率之间的关系:①MTHFR基因A1298C:AA基因型有效率为34.8%,AC基因型有效率为50.0%,CC基因型有效率为66.7%。②MDR1基因3489+59T>G:GG基因型有效率为56.0%,GT基因型有效率为39.1%,TT基因型有效率为31.3%。③MDR1基因3489+80C>T:CC基因型有效率为27.3%,CT基因型有效率为36.2%,TT基因型有效率为48.9%。统计学分析表明化疗有效率与3个位点的多态性均无关。结论:1、盐析法可以快速提取口腔拭子基因组DNA,得到DNA的质量较高,可以用于分子流行病学、遗传学和法医学等领域的研究。2、构象差异凝胶电泳对SNPs的分型是一种能在普通实验室开展的准确、简便、快速、低成本、高通量的SNPs分型方法。3、晚期胃癌患者MTHFR基因A1298C、MDR1基因3489+59T>G和3489+80C>T多态性均与以5-FU为基础的化疗方案的有效率无关。