出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans),俗称黑酵母,是一种广泛分布于植物表面和土壤中的多形态真菌,在发酵过程中可以产生两种不同类型的胞外多糖——普鲁兰和β-葡聚糖。普鲁兰是目前研究的最多的一种由出芽短梗霉合成的α型多糖,该多糖是由α-1,4-糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1,6-糖苷键聚合而成的水溶性高分子聚合物。普鲁兰独特的结构决定了其在食品加工、生物医药、环境保护等领域有着广泛应用前景。此外,出芽短梗霉还可代谢合成包含β-糖苷键结构的另一种不溶于水的胶状聚合物——β-葡聚糖,该多糖是通过β-1,3-糖苷键连接,极富生物活性,在食品、药品、化妆品和化工等各个领域越来越受到人们的关注。本论文以一株出芽短梗霉(A.pululans CCTCC M 2012259)为出发菌株,围绕其目标代谢产物普鲁兰和β-葡聚糖分别进行研究,探究微生物胞外多糖的生物合成机制。主要研究内容和结果如下:1、在分批发酵培养条件下,考察了葡萄糖、蔗糖和木糖这三种不同底物糖分别在初始浓度为50、100和150 g/L下对普鲁兰产量和分子量的影响。结果发现,蔗糖有利于获得更高的普鲁兰产量,是比葡萄糖和木糖更具优势的底物。同时,利用蔗糖合成普鲁兰的得率和生产强度也均能处于较高的水平。另一方面,利用葡萄糖为底物时,普鲁兰分子量要高于利用蔗糖和木糖时的结果,而随着初始底物糖浓度的提高以及发酵周期的延长,普鲁兰分子量逐渐下降。2、在摇瓶培养条件下,考察不同种类二价金属离子化合物对出芽短梗霉代谢产生胞外多糖的影响,研究发现硫酸锌可以显著促进β-葡聚糖的合成,在发酵培养基中添加0.1 g/L硫酸锌时,β-葡聚糖的产量最大。同时进一步从生理机制角度进行解析,硫酸锌的添加对合成过程中关键酶的活性以及前体物质UDPG的积累均有提高作用,细胞内ATP水平也有所上升,能量物质再生能力增强,有利于β-葡聚糖的合成。转录组分析结果表明,添加0.1 g/L硫酸锌后共筛选出188个差异表达基因,其中上调基因的有90个,下调的有98个。这些上调的基因涉及到细胞生长、能量和物质代谢的改变,进一步地糖原合成与代谢和能量代谢地相关基因也被激活或上调,这些都与β-葡聚糖的合成密切相关。特别地,硫酸锌的添加显著上调了Kre6基因和直接参与ATP合成的Coxl基因的表达水平,显示出硫酸锌的添加有利于β-葡聚糖合成途径和能量代谢途径中关键酶基因的表达,从而促进了β-葡聚糖的生物合成。另外,成功构建了普鲁兰和β-葡聚糖生物合成代谢网络。在细胞生长期,硫酸锌的添加导致碳通量更多地流向EMP途径,经过TCA循环进而合成更多的能量ATP用于细胞的正常代谢所需;在多糖的合成期,流向前体物质UDPG的碳通量以及由UDPG流向多糖合成的碳通量都有一定程度的提升。因此,硫酸锌的添加增加了流向β-葡聚糖的碳通量,最终提高了β-葡聚糖的产量。