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背景:非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一种常见的慢性肝脏代谢性疾病,其严重形式非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）表现为肝脏脂肪变性、炎症反应、气球样变和纤维化。流行病学研究表明,超过20%的NASH患者会发展为肝硬化甚至肝癌。同时,NASH还是肥胖、糖尿病等代谢性疾病以及心梗、动脉粥样硬化、脑卒中等心脑血管疾病的独立危险因素。肝脏从单纯脂肪变性发展到NASH是一个多因素共同参与的过程。脂质代谢紊乱导致肝脏脂肪变性及脂毒性物质累积,伴随着细胞应激损伤与细胞死亡,损伤相关分子模式释放,炎性细胞激活等多种因素,促进了肝脏由单纯脂肪变性向以炎症纤维化为特征的NASH的进展,但其具体过程及调控机制仍有待深入研究。作为一种重要的蛋白翻译后修饰方式,O-GlcNAcylation糖基化在体内参与了多种生命过程的调控,例如细胞内信号转导、基因表达调控、细胞能量代谢、细胞应激及细胞死亡等多种过程。O-GlcNAcylation糖基化修饰由糖基转移酶（O-GlcNAc transferase,OGT）和糖基水解酶（O-GlcNAcase,OGA）所调控,其平衡的破坏导致了多种疾病的发生。但是,O-GlcNAcylation糖基化修饰在NASH发生发展中的作用仍不明确,尤其是在NASH炎症反应中发挥何种调控作用仍有待研究。目的:（1）通过构建NASH动物模型和细胞模型,探究O-GlcNAcylation糖基化修饰在NASH发生发展中的作用。（2）利用蛋白质组学技术鉴定O-GlcNAcylation糖基化修饰靶蛋白,筛选可能在NASH中发挥作用的O-GlcNAcylation糖基化蛋白并进行验证。方法:（1）利用课题组前期构建的OGA肝细胞特异性敲除（hepatocyte-specific OGA knockout,OGA-LKO）小鼠,分别给予OGA-LKO小鼠和同窝对照小鼠胆碱蛋氨酸缺乏（methionine-choline deficient,MCD）饮食诱导NASH模型,造模结束后采用HE染色、油红O染色及天狼星红染色评价小鼠肝脏脂肪变性与纤维化程度。同时检测血清丙氨酸转氨酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST,进行肝脏F4/80免疫组化染色,以判断炎症损伤程度。（2）利用棕榈酸（palmitic acid,PA）处理HepG2细胞,建立NASH细胞模型,随后用OGA抑制剂TMG处理以提高O-GlcNAcylation糖基化水平,在体外探究O-GlcNAcylation糖基化对细胞脂滴生成及炎症损伤的影响。通过油红O染色观察细胞内脂滴,检测上清ALT、AST含量及细胞炎症因子表达水平以评价炎症损伤程度。（3）给予SK-Hep-1细胞TMG处理后,利用质谱鉴定差异表达蛋白。同时,利用O-GlcNAcylation糖基化抗体RL2进行免疫沉淀富集O-GlcNAcylation糖基化修饰靶蛋白并进行质谱检测。综合分析两次质谱结果,寻找下游O-GlcNAcylation糖基化靶分子并加以验证。结果:（1）OGA肝细胞敲除导致O-GlcNAcylation糖基化水平明显升高,HE染色和油红O染色显示,OGA敲除加重了 MCD饮食诱导的肝脏脂肪变及炎症反应。F4/80免疫组化结果表明,MCD饮食诱导下,OGA-LKO组巨噬细胞数目明显增多,同时可见数目更多的炎症细胞灶。ALT、AST检测表明,OGA-LKO组肝损伤程度更重。（2）给予HepG2细胞PA刺激可以提高细胞O-GlcNAcylation糖基化水平。同时,PA作为游离脂肪酸可以模拟NASH情况下的脂毒性刺激,促进肝细胞脂肪变与炎症损伤。而抑制OGA可以加重PA诱导的肝细胞脂滴生成与炎症损伤。（3）SK-Hep-1细胞给予TMG刺激后O-GlcNAcylation糖基化水平显著升高,质谱分析结果表明,与对照组相比,TMG处理组中上调的蛋白有187个,表达下调的蛋白有224个。免疫沉淀共富集到221个糖基化蛋白,这些蛋白主要富集在RNA代谢、蛋白质翻译、转录因子等相关通路。由于O-GlcNAcylation糖基化修饰可以通过抑制目的蛋白的泛素化以增加靶蛋白稳定性,提高蛋白表达水平,因此我们将TMG处理后表达上调的蛋白与IP联合质谱获得的蛋白取交集,得到了 18个候选的O-GlcNAcylation糖基化蛋白,在其中发现了在NASH中介导炎症反应的重要分子HMGB1。通过Western blot和Co-IP实验,证实了 O-GlcNAcylation糖基化升高后HMGB1蛋白表达水平上升。免疫共沉淀证实HMGB1可以被RL2抗体所富集,提示HMGB1存在O-GlcNAcylation糖基化修饰,可能参与NASH的发生发展。结论:O-GlcNAcylation糖基化修饰在NASH的发生发展中发挥重要作用,OGA肝细胞敲除导致O-GlcNAcylation糖基化水平明显升高,并且加重了 MCD饮食诱导的肝脏脂肪变及炎症反应。抑制OGA可以加重PA诱导的肝细胞脂滴生成与炎症损伤。O-GlcNAcylation糖基化可能通过修饰炎症调控分子HMGB1,提高其蛋白表达水平,以参与NASH的发生发展。