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质粒介导耐药基因水平散播是导致细菌耐药基因在菌属间广泛散播的最常见途径。IncFⅡ质粒是多重耐药大肠埃希菌中常见的接合型质粒之一,它的接合受多种因素的调控,其中全身/局部调节蛋白(如H-NS、CpxAR和Tra等)的调控作用尤为重要。但是,尚不清楚H-NS和CpxAR互作调控IncFⅡ质粒接合的分子机制。本研究以多重耐药鸡大肠埃希菌的IncFⅡ质粒为研究对象,利用Red同源重组分别构建大肠杆菌ATCC25922的cpxR和hns一系列基因缺失株及其回补菌株,进行药物敏感性分析,分别将携带blacTX-M-65、fosA3和rmtB耐药基因的IncFⅡ质粒电转入上述构建的菌株中,最终获得含有IncFⅡ质粒的8种重组菌。通过微量肉汤稀释法测定了各重组菌株的抗菌药物敏感性、生长曲线测定和质粒稳定性测定,以及IncFⅡ质粒和回补菌株中pBAD质粒的拷贝数,其次,以J53为受体菌,进行接合试验,计算接合频率,分析重组菌的质粒接合作用特征。同时,利用荧光定量PCR检测重组菌中与质粒接合转移相关tra、接合转移可育性抑制因子Fino、主动外排泵基因arcA、外膜蛋白ompA的相对mRNA表达水平;最后将可能受调控基因启动子区PY、PJ、PM序列连接到报告质粒,构建报告菌株,进行β-半乳糖苷酶活性测定,分析cpxR和hns对启动子的调控作用。通过药敏结果显示,cpxR能够影响大肠杆菌对多西环素的敏感性。hns可以负调控大肠杆菌对庆大霉素抗菌活性,也可能影响大肠杆菌对多西环素、氨苄西林的敏感性。另外,cpxR基因的缺失对细菌的生长速度无明显影响,hns基因的缺失导致细菌生长适应性变差,细菌的生长速度变慢。pEC01 1质粒在双缺失菌株FΔcpxRΔhns中稳定性较差;接合频率结果显示,cpxR和hns对IncFⅡ型质粒pEC0 11接合转移均呈负调控作用。IncFⅡ型质粒pEC0 11在双基因缺失株FAcpxRΔhns的接合频率介于两单缺FΔcpxR和FAhns之间。cpxR与hns对IncFⅡ型质粒的调控呈拮抗作用:相对mRNA表达量结果显示,大肠杆菌的H-NS可显著下调接合转移tra相关基因ttraJ、traY、traM、traL、traF、traE、traA的mRNA表达量,且对traJ和traE的调控作用更强。CpxR可显著下调traY、traJ、traM的mRNA表达量,也可上调traL、traE、fino的mRNA表达量,对traF、ompA、acrA无明显调控作用。回补菌株FΔcpxR/pcpxR和FΔhns/phns对所有待测基因的mRNA的相对表达量均有不同程度的恢复。更进一步证明,CpxAR与H-NS在调控tra相关基因中呈拮抗作用;β-半乳糖苷酶活性结果显示,cpxR可减弱tra相关启动子PY、PJ、PM的活性。hns也可减弱tra相关启动子PY、PJ、PM的活性。且对PY启动子调控作用更强。双基因缺失株对三个启动子的活性均处于两单缺失株之间,说明cpxR和hns对启动子PY、PJ、PM活性的调控呈拮抗作用。综上所述,核蛋白H-NS和双组份信号转导系统CpxAR对IncFⅡ质粒pEC011的接合转移呈拮抗作用,为控制IncFⅡ质粒介导的多重耐药基因水平快速散播提供理论依据。