论文部分内容阅读
心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)损伤常发生于心肌梗死的治疗过程,对心肌组织危害极大,甚至会产生不可逆的损伤。在IR损伤过程中,粘附分子如血管细胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule,VCAM)和细胞间粘附分子(intracellular adhesion molecule,ICAM)过量表达,介导中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)浸润,导致严重的炎症反应并释放大量的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),进一步恶化IR损伤。使用小分子抑制剂是目前临床进行IR抗炎治疗的有效方法。然而,抑制剂高昂的治疗成本和副反应成为其抗炎治疗的主要限制因素。基因治疗具有特异性好、效率高、持续时间长等优点。通过递送siRNA下调粘附分子的表达,可阻断中性粒细胞募集,抑制炎症反应,最终达到治疗IR损伤的目的。基因治疗需要高效的基因递送载体,阳离子聚合物是其中重要的一类,它可以通过所携带的正电荷缩合负电荷的核酸分子,从而促进靶细胞的摄取,促进基因转染。但是阳离子聚合物存在转染效率与细胞毒性的不一致性,分子量较高的聚合物通常转染效率高但细胞毒性大,严重限制其应用。因此可降解的刺激响应型聚合物应运而生。基于此,我们设计了以下两种刺激响应型聚合物基因递送体系,用于IR损伤的抗炎治疗:1还原响应型支化聚β-氨基脂递送ICAM-1 siRNA治疗心肌缺血再灌注损伤我们设计并合成了含二硫键的还原响应型支化聚β-氨基酯(bioreducible branched poly(β-amino ester),BPAE-SS),用于递送 ICAM-1 siRNA,抑制 IR 损伤后的炎症反应,治疗IR损伤。具有支化结构的BPAE-SS可高效复合siRNA形成纳米复合物(～150 nm)。与线性聚合物相比,BPAE具有更强的siRNA缩合能力以及更高的细胞摄取水平。经内吞进入细胞的BPAE-SS/siICAM-1纳米复合物可通过质子海绵效应实现内涵体逃逸,在细胞内高浓度的谷胱甘肽(glutathione,GSH)刺激下,二硫键断裂、BPAE-SS降解,迅速释放出ICAM-1 siRNA,发挥基因沉默的作用。在脂多糖(LPS)诱导的RCMECs细胞中,BPAE-SS/siICAM-1复合物可降低75%的ICAM-1 mRNA表达。在大鼠心肌IR损伤模型中,尾静脉注射的BPAE-SS/siICAM-1复合物可降低损伤组织中79%的ICAM-1 mRNA表达,显著降低促炎因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的表达水平,有效抑制炎症反应。BPAE-SS/siICAM-1给药组的大鼠心肌梗死面积减少至6%,心脏组织纤维化程度降低至8%,心脏坏死情况显著改善,心肌细胞凋亡率降低至9%,心脏超声检测左心室收缩功能基本恢复。2心脏血管内皮细胞靶向的ROS响应型交联聚酰胺胺共递送ICAM-1和VCAM-1 siRNA治疗心肌缺血再灌注损伤我们设计并合成了含缩硫酮键的ROS可降解的交联聚酰胺胺(ROS degradable poly(amido-amine),RP),并修饰 PEG 和 cRGD(RPPR),用于共递送ICAM-1和VCAM-1 siRNA治疗心肌缺血再灌注损伤。RPPR具有ROS响应性和良好的血清稳定性,在血清中粒径稳定在150-180 nm。在LPS诱导的RCMECs细胞中,RPPR可沉默76%的ICAM-1 mRNA表达。共递送siICAM-1和siVCAM-1的复合物(RPPR/siCAM2)可沉默>70%的TNF-α mRNA表达,沉默效率高于对照组 RPPR/siICAM-1(40%)和 RPPR/siVCAM-1(41%),具有协同抗炎效果。在大鼠心肌IR损伤模型中,RPPR能有效在心脏组织富集并通过cRGD介导的主动靶向进入损伤部位的血管内皮细胞中。在胞内高浓度的ROS作用下,RPPR中的缩硫酮键迅速断裂,复合物解离并释放ICAM-1 siRNA和VCAM-1 siRNA,从而同时沉默ICAM-1和VCAM-1的表达,进一步降低TNF-αmRNA表达(77%),其沉默效率显著高于RPPR/siICAM-1复合物(54%)和RPPR/siVCAM-1复合物(57%)。RPPR/siCAM2给药组的大鼠心肌梗死面积减少至7%,心脏组织纤维化程度降低至9%,心脏坏死情况显著改善,心肌细胞凋亡率降低至8%,心脏超声检测左心室收缩功能基本恢复。