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一.研究背景:
帕金森病(Parkinsons disease,PD)是常见的神经系统变性疾病之一,其病理为黑质致密部多巴胺能神经元变性及死亡,并伴有残存神经元内出现路易氏小体。大量证据表明,凋亡是黑质多巴胺能神经元细胞死亡的主要机制,而且线粒体氧化应激是凋亡的关键。
鱼藤酮作为线粒体复合物Ⅰ抑制剂,能够增加活性氧的生成及细胞内谷胱甘肽的消耗,导致氧化损伤,进而增加线粒体通透性,引起线粒体膜电位的去极化,诱导凋亡。分化PC12细胞具有典型的多巴胺能特征。因此,鱼藤酮诱导的分化PC12细胞模型可作为研究PD线粒体氧化应激机制的很好模型。
PD仍是以内科治疗为主,尽管许多药物如左旋多巴能有效缓解PD症状,但是长期使用这些药物常常会出现严重副作用,这些药物无法阻止疾病的进展。因此,很有必要寻找有效且副作用少,能阻止或逆转该疾病的药物。利福平作为利福霉素的半合成衍生物,临床应用已有40余年历史,具有良好的安全性,研究表明其除有杀菌作用外,尚具抗凋亡和神经保护作用。我们的前期实验也证实了这一神经保护作用。然而,利福平介导这一作用的具体机制尚不明确。有研究表明,利福平可能作为自由基清除剂起神经保护作用。且迄今为止,尚未见体外鱼藤酮诱导的细胞模型上研究线粒体氧化应激与利福平神经保护作用相关性的报道。
基于上述的理论基础和研究背景,本研究选择鱼藤酮诱导分化PC12细胞构建线粒体氧化应激的PD细胞模型,进一步探讨和研究利福平神经保护和抗细胞凋亡的相关机制。
二.研究目的:
1.鱼藤酮诱导分化PC12细胞构建线粒体氧化应激的PD细胞模型。
2.探讨利福平对鱼藤酮诱导的细胞线粒体膜电位、活性氧及谷胱甘肽的影响。
3.明确利福平对鱼藤酮诱导的PD细胞模型的保护作用。
4.探讨利福平的神经保护作用机制,为其用于PD的临床治疗提供依据。
三.实验对象和方法:
1.细胞培养及分组:PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株细胞)经100ng/ml7S神经生长因子处理9天成分化细胞后培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12中,并孵育在含5% CO2的37℃培养箱中。隔天更换培养基。根据不同的处理条件分成六组:对照组(常规加培养基)、利福平组(300μmol/L利福平作用26h)、鱼藤酮组(2.5μmol/L鱼藤酮作用24h)和三组利福平预处理组(先分别给予100,200 and300μmol/L利福平预处理2h,然后2.5μmol/L鱼藤酮再作用24h)。
2.检测方法:(1) MTT法检测细胞活性;(2) Hoechst33342核染和流式细胞仪检测细胞凋亡;(3)荧光显微镜和流式细胞仪测量经罗丹明123标记的线粒体膜电位;(4)流式细胞仪分析DCFH—DA标记的细胞内活性氧生成;(5)酶标仪检测细胞内还原型谷胱甘肽。
3.统计分析:数据以均数±标准差表示,应用SPSS16.0统计软件,采用单因素方差分析,处理组间的两两比较用LSD—t检验,P<0.05认为有统计学意义。
四.实验结果:
2.5μmol/L鱼藤酮作用24h能增加分化PC12细胞凋亡同时促进细胞线粒体膜电位去极化、增加活性氧生成及谷胱甘肽耗竭;当细胞经过100,200 and300μmol/L利福平预处理2h后,鱼藤酮诱导的这一线粒体功能障碍能够被利福平以剂量依赖的方式阻断。
五.实验结论:
1.利福平能降低鱼藤酮诱导的分化PC12细胞线粒体膜电位去极化、活性氧含量生成及还原型谷胱甘肽的消耗。
2.利福平能抑制鱼藤酮诱导的分化PC12细胞凋亡。
3.利福平对鱼藤酮诱导分化PC12细胞的线粒体损伤具保护作用,并存在剂量—效应关系。