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脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）又名呕吐毒素,在我国是常见的一种真菌毒素。基于抗原抗体特异性识别与结合的免疫分析方法在监测真菌毒素的污染方面发挥着重要作用,其中免疫层析试纸方法又以其操作简单、快速等优点在包括真菌毒素在内的食品安全快速检测领域应用广泛。然而,传统的小分子抗原的免疫分析方法中的关键核心原料（检测抗原）主要以化学合成的方式为主,仍然面临着制备流程长、批次误差大、成本高及易造成环境污染等众多问题。本研究在前期获得呕吐毒素的抗原模拟表位（D6）的基础上,基于丙氨酸扫描技术,开展了D6的丙氨酸定点饱和突变研究,以期解析影响其免疫分析功能的关键氨基酸,并在此基础上将D6的突变体与麦芽糖结合蛋白（MBP）、纳米荧光素酶进行了融合表达。分析了其作为包被抗原和竞争酶标抗原的免疫分析性能,在此基础上建立了基于D6突变体的呕吐毒素免疫层析试纸检测方法,取得的主要研究进展如下:1)基于丙氨酸扫描技术,定向突变了D6的七个关键氨基酸,并构建了七个D6突变体与MBP融合蛋白的表达载体,并基于大肠杆菌表达体系,实现了上述七个D6突变体-MBP融合蛋白的生物合成。基于ELISA检测结果发现,D6-25A-MBP与呕吐毒素抗体的结合活性受到了显著影响,提示D6的第5位组氨酸为关键氨基酸残基;并通过非竞争ELISA方法,测定了D6-21A-MBP、D6-22A-MBP、D6-23A-MBP、D6-24A-MBP、D6-26A-MBP、D6-27A-MBP和D6-S-MBP分别为包被抗原时,呕吐毒素抗体的亲和力常数分别为4.5×10~6、1×10~8、0.9×10~8、1.47×10~8、2.1×10~7、1.8×10~7 L/mol和4.0×10~6 L/mol。2)为解析多肽抗原模拟表位中氨基酸组成的排列顺序对其结合抗体的能力及特异性的影响,本研究还设计了与D6的氨基酸序列具有镜像组成差异的D6突变体（D6-S-MBP）,研究结果发现D6的镜像突变体仍保留了与呕吐毒素单克隆抗体结合的能力,然而与D6原体相比,基于D6-S-MBP为检测抗原的间接竞争ELISA的IC50数值增大为196.56±4.19 ng/m L,提示镜像结构会影响其与抗体的结合能力。3)选取含有编码纳米荧光素酶NLuc的质粒p ET-22b-NLuc,将其进行双酶切后与制备的三种D6突变体的目的基因片段进行了酶连,成功制备了三种D6突变体-NLuc融合蛋白的表达载体p ET-D6-24A-NLuc,p ET-D6-26A-NLuc和p ET-D6-S-NLuc,并获得了D6突变体-NLuc高纯度的融合蛋白。经直接竞争ELISA验证,结果显示D6-24A-NLuc,D6-26A-NLuc和D6-S-NLuc三种融合蛋白作为竞争抗原时,均可与呕吐毒素单克隆抗体特异性结合,并且可与呕吐毒素标准品竞争性结合抗体。在1.5 ng/m L的标准品浓度下,基于D6-24A-NLuc,D6-26A-NLuc和D6-S-NLuc的ELISA的抑制率分别为32%、2%、10%。直接竞争ELISA的结果表明,将D6抗原模拟表位与荧光素酶进行融合表达,制备的D6突变体-荧光素酶具有作为酶标抗原替代物的应用前景。4)分别构建了基于D6-MBP、D6-24A-MBP融合蛋白为T线检测抗原的呕吐毒素免疫层析试纸条。开展了基于D6-MBP、D6-24A-MBP融合蛋白的呕吐毒素免疫层析试纸性能评估,结果显示,在试纸的样本孔中加入呕吐毒素时,随着呕吐毒素标准品浓度的增加,试纸条上的T线颜色逐渐降低,呈现典型的竞争抑制曲线,其IC50值分别为50±2.15 ng/m L,56±3.12 ng/m L。当呕吐毒素标准品的浓度达到125,135 ng/m L时,基于D6-MBP、D6-24A-MBP的呕吐毒素免疫层析试纸条上的T线完全不显色,设定该浓度为免疫层析试纸的肉眼检测阈值;特异性验证实验结果表明,建立的两种呕吐毒素免疫层析试纸均只特异性结合呕吐毒素,而与其它真菌毒素不结合。5)选取玉米、小麦、燕麦等呕吐毒素阴性样本,人工添加呕吐毒素标准品至样本中进行加标回收实验评估建立的免疫层析试纸的准确度,结果显示,对于D6-MBP的呕吐毒素免疫层析试纸,玉米、小麦、燕麦样本的回收率分别为96～116.6%、96.67～103%、95～102%;对于D6-24A-MBP的呕吐毒素免疫层析试纸,玉米、小麦、燕麦样本的回收率分别为83～101.0%、96.67～101%、88.3～106.67%。进一步地选取了30份实际样本,分别用本研究建立的免疫层析试纸及UPLC-Qq Q-MS方法进行检测,结果显示,其中三份小麦一份燕麦样本检出呕吐毒素,玉米样本未检出呕吐毒素,该结果与UPLC-QqQ-MS检测方法的结果相一致。