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第一部分四种circRNA在肝组织中的表达水平及对肝癌的诊断价值目的:检测hsa＿circRNA＿404974、hsa＿circRNA＿001387、hsa＿circRNA＿100246和hsa＿circRNA＿091581四种circRNA在肝癌患者癌组织及其癌旁组织中表达量,分析在肝癌组织及其癌旁中存在差异表达的circRNA在肝癌组织中的表达量与肝癌患者临床基本信息的关系,并探讨哪种circRNA可以作为肝癌分子诊断标志物。方法:1.应用q RT-PCR技术,分析55对肝癌患者癌组织及其癌旁组织中hsa＿circRNA＿404974、hsa＿circRNA＿001387、hsa＿circRNA＿100246和hsa＿circRNA＿091581的相对表达量。2.分析在肝癌组织及其癌旁组织中有差异表达circRNA的表达量与肝癌患者临床资料的关系。3.根据circRNA在肝组织中的表达量,应用ROC曲线分析其是否可以作为肝癌分子诊断标志物。4.本文数据采用SPSS21.0软件进行统计学分析,circRNA在肝癌患者癌组织和配对的癌旁组织的差异表达,应用符号秩和检验进行显著性分析;circRNA在癌组织中的表达量与临床资料的分析,应用Wilcoxon秩和检验;诊断试验应用ROC曲线进行分析。结果:1.q RT-PCR方法检测四种circRNA在55例肝癌患者癌组织和癌旁组织的结果表明,hsa＿circRNA＿404974在肝癌患者癌组织中的表达量显著低于其癌旁组织(P<0.001);hsa＿circRNA＿001387在肝癌患者癌组织中的表达量显著高于其癌旁组织(P<0.001);hsa＿circRNA＿100246在肝癌患者癌组织中的表达量显著低于其癌旁组织(P<0.001);hsa＿circRNA＿091581在肝癌组织和配对的癌旁组织中的表达量无统计学差异(P>0.05)。2.患者癌组织中circRNA的表达量与患者临床基本信息分析显示:hsa＿circRNA＿404974在肝癌组织中的表达量与患者肝内肿瘤个数及瘤旁子灶有关(均P<0.05);hsa＿circRNA＿001387在肝癌组织的表达量与患者AFP水平有关(P<0.05);hsa＿circRNA＿100246在肝癌组织的表达量也与患者AFP水平有关(P<0.05)。3.根据circRNA在肝组织中的表达量绘制ROC曲线,hsa＿circRNA＿404974结果显示,ROC曲线下面积为0.896,P<0.001,95%可信区间为(0.828,0.964),灵敏度为83.64%,特异度为90.91%,准确度为87.27%;hsa＿circRNA＿001387结果显示,ROC曲线下面积为0.884,P<0.001,95%可信区间为(0.816,0.952),灵敏度为80.00%,特异度为90.91%,准确度为85.45%;hsa＿circRNA＿100246结果显示,ROC曲线下面积为0.714,P<0.001,95%可信区间为(0.619,0.809),灵敏度为81.82%,特异度为54.55%,准确度为68.18%;联合诊断试验结果显示,ROC曲线下面积为0.953,P<0.001,95%可信区间为(0.912,0.994),灵敏度为90.91%,特异度为90.91%。结论:1.hsa＿circRNA＿404974在肝癌组织中低表达,与患者肝内肿瘤个数和瘤旁子灶有关,可能参与肝癌的发生发展,以hsa＿circRNA＿404974作为肝癌分子标志物,诊断价值较好。2.hsa＿circRNA＿001387在肝癌组织中高表达,与患者AFP水平有关,可能参与肝癌的发生发展,以hsa＿circRNA＿001387作为肝癌分子标志物,诊断价值较好。3.hsa＿circRNA＿100246在肝癌组织中低表达,与患者AFP水平有关,可能参与肝癌发生发展,但以hsa＿circRNA＿100246作为肝癌分子标志物,诊断价值较差。4.hsa＿circRNA＿091581在肝癌组织中的表达水平和配对癌旁组织中的表达水平无统计学意义,可能没有参与肝癌的发生发展。第二部分hsa＿circRNA＿404974的稳定过表达对肝癌细胞功能影响目的:构建hsa＿circRNA＿404974稳定过表达细胞,探索其对肝癌细胞系增殖、迁移和侵袭功能的影响。方法:1.应用细胞单克隆培养技术构建hsa＿circRNA＿404974稳定过表达的肝癌细胞克隆。2.应用CCK8实验分析hsa＿circRNA＿404974在肝癌细胞系中过表达对细胞增殖功能的影响。3.应用克隆形成实验分析hsa＿circRNA＿404974在肝癌细胞系中过表达对细胞增殖功能的影响。4.应用Transwell迁移实验分析hsa＿circRNA＿404974在肝癌细胞系中过表达对细胞迁移功能的影响。5.应用Transwell侵袭实验分析hsa＿circRNA＿404974在肝癌细胞系中过表达对细胞侵袭功能的影响。结果:1.应用q RT-PCR技术对克隆重组细胞进行两次筛选,从QGY-7703和Huh-7两种肝癌细胞系中各筛选出两株hsa＿circRNA＿404974稳定过表达细胞克隆和一株阴性对照(nc)细胞克隆,即QGY-7703肝癌细胞的克隆(clone)3、clone15和nc,Huh-7肝癌细胞的clone5、clone6和nc。这6株肝癌细胞克隆,被用于后续的细胞功能实验研究。2.hsa＿circRNA＿404974过表达的肝癌细胞CCK8实验结果显示:在肝癌细胞系QGY-7703中,细胞培养48h和72h后clone3和clone15与nc的吸光度值(Optical density,OD)比较,均无统计学差异(P>0.05);在肝癌细胞系Huh-7中,细胞培养0h、24h、48h和72h后clone5和clone6与nc的OD值比较,均无统计学差异(P>0.05)。3.hsa＿circRNA＿404974过表达的肝癌细胞克隆形成实验结果显示:在肝癌细胞系QGY-7703中,clone3和clone15的克隆形成数与nc比较均无统计学意义(P>0.05);在肝癌细胞系Huh-7中,clone5和clone6的克隆形成数与nc比较均无统计学意义(P>0.05)。4.hsa＿circRNA＿404974过表达的肝癌细胞Transwell迁移实验结果显示:在肝癌细胞系QGY-7703中,clone3和clone15穿过Transwell小室基底膜的细胞数量显著少于nc(均P<0.05);在肝癌细胞系Huh-7中,clone5和clone6穿过Transwell小室基底膜的细胞数量也显著少于nc(均P<0.05)。5.hsa＿circRNA＿404974过表达的肝癌细胞Transwell侵袭实验结果显示:在肝癌细胞系QGY-7703中,clone3和clone15穿过Transwell小室基质胶的细胞数量显著少于nc(P<0.05);在肝癌细胞系Huh-7中,clone5和clone6穿过Transwell小室基质胶的细胞数量也显著少于nc(P<0.05)。结论:1.通过药物筛选细胞,成功构建hsa＿circRNA＿404974在QGY-7703和Huh-7两种肝癌细胞系稳定过表达细胞株。2.hsa＿circRNA＿404974的过表达对细胞增殖能力未产生影响,但能抑制细胞的迁移和侵袭能力,可能参与肿瘤的转移。