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在过去的几十年内,由于生活方式的巨大变化,非酒精性脂肪肝炎(NASH)已成为目前全球最为常见的慢性肝脏疾病。NASH正迅速成为肝脏移植以及肝癌(HCC)的重要诱因,也是心血管疾病(CVDs)的高危因素。NASH发病率的急剧持续增长给个人及社会都造成巨大的经济负担。由于缺乏有效的药物治疗,NASH造成的社会负担将会继续攀升,迫切需要在分子机制和药物研发方面开展研究。在所有NASH患者中,不同个体的致病因素因其所处地域或种族的不同存在很大差异,NASH发生发展期间的复杂机制无疑给研发NASH有效治疗手段带来了巨大挑战。凋亡信号调节激酶1(ASK1)是丝裂原活化蛋白3激酶家族的成员,它是NASH发生中一个重要的激活因子。在代谢应激下,ASK1的持续性激活能够通过JNK1/2-p38信号通路促进肝脏炎症和纤维化进展。因此,抑制ASK1的活化已成为NASH治疗药物开发的主要靶点。多年研究发现,ASK1抑制剂GS4997可以通过非选择性抑制ASK1磷酸化激活对NASH发挥治疗作用,然而其III期临床治疗效果并不理想。我们推断,在保持其正常功能情况下,ASK1活性的最优调控有望成为NASH治疗的靶点。泛素化修饰是精确调控ASK1活性的主要机制。然而,参与NASH进展中通过介导ASK1泛素化参与其活性调控的关键E3泛素连接酶,以及泛素化在NASH中的具体作用尚缺乏系统性研究,ASK1活化介导NASH发生的确切分子机制依然未完全阐明。肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)家族是一类常见的E3泛素连接酶,已被证实参与NASH发展过程。并且研究表明,其中多个TRAFs成员可与ASK1发生互作并参与其活性调控。我们猜测TRAFs家族很可能参与介导NASH病理状态下ASK1的泛素化修饰。因此,我们从ASK1活性调控出发,对TRAFs家族进行了筛选并对TRAF6在NASH发生发展中的功能及分子机制进行了系统性研究。棕榈酸(PA)刺激是一种模拟NASH发生发展的常用体外模型,无论是细胞系还是原代肝细胞,PA刺激合适的时间,都能够显著诱导细胞的炎症发生及脂质合成。因此,我们首先对PA刺激下的ASK1过表达L02细胞进行了RNASeq分析,结果表明激活ASK1确实能够促进肝细胞炎症反应。接着,通过体外条件培养基transwell系统模拟体内肝脏细胞微环境,我们证实ASK1能够通过诱导肝细胞分泌促炎因子对代谢应激做出反应,进而增强肝星状细胞(HSCs)的活化。下一步,我们对TRAFs家族成员进行了ASK1磷酸化活化、蛋白互作以及荧光素酶报告基因分析筛选,发现TRAF6激活ASK1磷酸化、诱导AP-1启动子活化能力最为显著,与ASK1互作最强。进一步研究证实了二者的直接相互作用是通过ASK1的N末端与TRAF6的C末端相结合实现的,并随PA诱导呈时间依赖性增强。这些结果表明,TRAF6可能是肝细胞中PA刺激下ASK1活性的关键激活因子。其次,通过建立C57BL/6J小鼠NASH模型,我们发现TRAF6在NASH发生发展过程中表达显著上升。降低TRAF6的表达能够显著减轻高脂高胆固醇(HFHC)喂养诱导的肝脏炎症及纤维化;相反,利用TRAF6腺相关病毒(AAV8-TRAF6)在小鼠肝脏中特异性过表达TRAF6,则能够明显加重HFHC喂养诱导的肝脏炎症和纤维化反应。通过细胞水平进一步研究发现,敲除TRAF6能够抑制ASK1-JNK1/2-p38信号通路激活;过表达TRAF6则能够显著激活ASK1介导的炎症信号通路,并能够促进人和大鼠肝星状细胞(HSCs)的活化以及纤维化相关因子的表达,而这些功能都依赖于ASK1。这些研究显示TRAF6对NASH的发生发展起重要促进作用,而ASK1的激活则是调控TRAF6在NASH发生中分子机制的关键靶点。第三,我们深入开展了TRAF6介导的ASK1泛素化在NASH进展中分子机制的研究。我们发现TRAF6虽然介导ASK1多种类型泛素化修饰,但只有K6泛素化随PA诱导时间增加呈现递增趋势,并依赖于TRAF6自身的E3泛素连接酶活性,提示ASK1-K6泛素化是代谢应激下ASK1活化的关键因素。ASK1-K6泛素化能够促进Trx与ASK1的解离以及TRAF6诱导的ASK1的N端二聚化,进而促进ASK1-JNK1/2-p38信号通路的激活。我们进一步确定了ASK1-K6泛素化修饰的位点,即位于1-678氨基酸区域的Lys398,Lys458,Lys500,Lys505,Lys596,Lys597,Lys644和Lys645。当将这8个位点全部突变为R时,TRAF6介导的ASK1泛素化消失、ASK1的N端二聚化减弱,并且对炎症信号通路的激活以及对HSCs的活化作用也明显受到抑制。这些结果表明,TRAF6介导的ASK1-K6泛素化能够促进Trx从ASK1上解离,从而使ASK1发生二聚化而激活,诱导炎症因子(如CXCL10)的释放,进而促使静止的HSCs分化为活化的肌成纤维细胞,导致肝脏纤维化的发生。综上所述,我们鉴定了TRAF6是NASH病理状态下ASK1的重要激活因子,通过催化ASK1发生一种新型的泛素化修饰-K6促进应激状态下Trx与ASK1的解离,进而促进ASK1的N端二聚化及磷酸化激活。活化的ASK1发挥其MAPK3K激酶活性,激活下游MKK4/7-JNK1/2-p38信号通路,最终诱导AP-1的激活导致炎症反应发生,同时也促进了肝脏纤维化进程。我们的研究表明TRAF6介导的ASK1-K6泛素化修饰是导致ASK1在代谢应激作用下过度激活的主要原因,具有一定的临床转化价值,有望成为NASH治疗的一个潜在分子靶点。