论文部分内容阅读
镍暴露可导致不同的健康危害。短期、高浓度镍暴露可诱导细胞凋亡；长期、慢性、低浓度镍暴露却可诱导细胞转化。近些年研究显示,Akt信号通路在调节细胞生长、存活、增值、凋亡、血管形成、代谢以及细胞迁移等方面发挥重要作用。Akt信号通路的异常与细胞凋亡和细胞转化都密切相关。但是,关于Akt信号通路是否在镍诱导的细胞凋亡和细胞转化中发挥作用尚无报道。本研究将探讨Akt及其下游信号通路在镍诱导的细胞凋亡和细胞转化中的作用及其机制。第一部分ROS介导的Akt／ASK1／p38信号通路在镍诱导的BEAS2B细胞凋亡中的作用目的：重点探讨活性氧(Reactive oxygen species, ROS)介导的Akt／细胞凋亡调节信号激酶1(Apoptosis-regulating signal kinase, ASK1)／p38丝裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)信号通路的活化在镍化合物诱导的人支气管上皮(human bronchial epithelial cells, BEAS2B)细胞凋亡中的作用。方法：利用AnnexinV-FITC/Propidium Iodine凋亡检测试剂盒,采用流式细胞仪检测分析不溶性结晶型镍化合物二硫化三镍(nickel subsulfide, Ni3S2)诱导BEAS2B细胞凋亡情况；利用BECKMAN COULTER仪器进行细胞计数,检测镍化合物对细胞生长情况的影响；分别运用分子探针CM-H2DCFDA和DHE,利用流式细胞仪测定镍化合物诱导BEAS2B细胞内ROS主要是H2O2和O2-产生情况；采用蛋白免疫印迹(Western Blotting)方法测定相关蛋白,包括Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达情况、细胞内过氧化氢酶、超氧化物岐化酶1(Superoxide dismutase 1, SOD1)、SOD2以及信号通路中相关激酶Akt、磷酸化Akt(phospho-Akt Ser473)、ASK1、phospho-ASK1 Thr838、phospho-ASK1 Ser83、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK蛋白表达情况；运用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)、维生素E、过氧化氢酶预处理BEAS2B细胞,检测其对镍化合物诱导的细胞凋亡、ROS产生以及相关信号传导激酶表达的影响；采用小RNA干扰(small interfering, siRNA)技术,分别下调ASK1和Akt表达后,对相关下游激酶表达和对细胞凋亡的影响。结果：流式细胞仪检测结果显示,不同浓度的镍化合物处理诱导了BEAS2B细胞凋亡；细胞计数实验也证实镍化合物处理可导致细胞数量的减少,呈明显的剂量和时间反应关系；同时,细胞形态也随之发生改变,从典型的上皮细胞样形态变成类似成纤维样细胞形态。Western Blotting实验进一步显示镍化合物诱导Bcl-2家族成员中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的下调。另外,在镍化合物诱导的细胞凋亡中,ROS主要是H2O2的产生增加。与此结果一致的是,镍化合物诱导细胞内过氧化氢酶(可特异性地清除H2O2)的蛋白表达下调,而对SOD1、SOD2(可特异性地清除O2-)没有影响。在镍化合物诱导的细胞凋亡中,phospho-Akt Ser473、phospho-ASK1 Thr838、phospho-p38 MAPK表达均增加,说明镍化合物通过激活信号转导通路中的激酶Akt、ASK1、p38 MAPK诱导细胞凋亡。采用siRNA技术下调ASK1的表达,引起下游p38 MAPK的磷酸化水平明显下降,证实ASK1是p38MAPK的上游激酶,调节p38 MAPK的活性。反之,采用p38 MAPK抑制剂SB203580抑制p38 MAPK,对ASK1的活性没有影响,提示p38 MAPK不能逆向调节上游激酶ASK1。siRNA下调Akt表达后,镍化合物诱导的ASK1和p38 MAPK磷酸化水平也明显减弱,诱导的细胞凋亡亦有所缓解；仅仅采用siRNA技术下调Akt表达而缺乏镍化合物刺激细胞,ASK1和p38 MAPK的磷酸化水平没有发生变化,说明镍化合物通过激活Akt／ASK1／p38 MAPK通路诱导细胞凋亡。采用抗氧化剂NAC、过氧化氢酶及维生素E降低ROS的产生后,镍化合物诱导的Akt、ASK1、p38的磷酸化水平也随之下降,细胞凋亡也随之缓解,说明镍化合物诱导的Akt／ASK1／p38通路的激活受到ROS的调节。结论：本研究结果显示,镍化合物通过ROS介导的Akt／ASK1／p38的通路诱导细胞凋亡。第二部分非ROS依赖的Akt／GSK3β和Akt／Bcl-2信号通路在镍化合物诱导的BEAS2B细胞转化中的作用目的：调查Akt及其下游信号通路在镍化合物诱导的BEAS2B细胞转化中的作用。方法：采用水溶性镍化合物氯化镍(nickel chloride, NiCl2)慢性低浓度(0、25、50、75、100μM)处理BEAS2B细胞诱导其转化。软琼脂克隆形成实验判断镍转化细胞的锚定不依赖性生长特性。运用磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)抑制剂LY294002、Akt抑制剂B2311处理镍转化细胞,检测对镍转化细胞的生长速度、软琼脂克隆形成能力的影响。其它实验方法如细胞培养、细胞计数、ROS检测、WesternBlotting、siRNA转染实验等同第一部分。结果：采用NiCl2慢性低浓度(25、50、75、100μM)处理BEAS2B细胞6个月后诱导了细胞转化。软琼脂克隆形成实验证明,镍处理的细胞能够在软琼脂上形成克隆,而对照组细胞无此能力。比起对照组细胞,转化细胞也显示了较快的生长速度以及改变的细胞生长方式,转化细胞呈片状、簇状生长。Western Blotting实验结果显示,与对照组相比,转化细胞中phospho-Akt Ser 473位点的磷酸化明显增强。但是MAPK家族,包括p38,JNK,和ERK,蛋白的磷酸化水平,在转化细胞和对照组细胞间差异不明显。采用PI3K抑制剂和Akt抑制剂,降低Akt的表达后,转化细胞的生长速度和在软琼脂中克隆形成能力均下降,说明镍通过激活PI3K／Akt通路诱导细胞转化。另外,研究也显示,镍转化细胞中Akt激酶的下游底物,糖原合成激酶3β(glycogen synthesis kinase 3β, GSK3β)Ser9位点的磷酸化水平增加,说明在镍转化细胞中Akt可磷酸化下游底物GSK3βser9抑制GSK3β的促凋亡作用而诱导细胞转化。另外, Bcl-2家族成员中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达在转化细胞中明显增加。采用siRNA干扰技术下调Akt表达,镍转化细胞中Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达亦随之下降,说明在镍转化细胞中,Akt位于Bcl-2和Bcl-xL的上游,调节Bcl-2和Bcl-xL的表达。与预期结果向左,镍诱导的转化细胞中ROS的产生不但没有增加,与对照组细胞相比反而有所下降。另外,在镍诱导的转化细胞中,与对照组细胞相比较,抑癌基因p53、癌基因c-Myc以及Ras的蛋白表达没有差异,但是抑癌基因Rb的蛋白表达较对照组细胞下降。结论：镍化合物可能通过非ROS依赖的Akt／GSKβ、Akt／Bcl-2和Bcl-xL通路的激活协同抑癌基因Rb蛋白的下调诱导BEAS2B细胞转化。