目的和意义超氧化物歧化酶(SODs, EC 1.15.1.1)通过歧化作用催化分解超氧化物成氧和过氧化氢,是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶,对暴露在氧气的生物体中发挥重要的抗氧化防御作用。它能专一清除生物体内的超氧阴离子自由基。抵御氧自由基和其他氧化物自由基对细胞质膜、蛋白酶及其它生物大分子和细胞器的损害,并能消除外源氧自由基对机体的损伤,故在维持机体氧自由基平衡方面起重要作用。因为超氧化物歧化酶类型的多种多样和其重要的职能,超氧化物歧化酶被用作细胞应激和软体动物、蚌和鱼等不同的水生生物毒性的生物标志物。超氧化物歧化酶也正在越来越多地用作模型蛋白来研究蛋白质的折叠和去折叠。酪氨酸酶(EC 1.14.18.1, Tyrosinase)是一种结构复杂的多亚基的含铜氧化还原金属酶,在黑色素合成过程中具有多种重要催化功能,广泛分布于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶在植物中一般称为多酚氧化酶；在昆虫中则称为酚氧化酶；在微生物和人体中才称为酪氨酸酶。酪氨酸酶缺乏与哺乳动物色素形成异常直接相关并导致蔬菜褐变效果。酪氨酸酶还在昆虫的表面角质层形成中起作用。随着热力学和动力学等生物物理学技术的发展,认为一些蛋白质具有稳定的中间构象态存在；三氟乙醇是蛋白质折叠研究中最常用的变性剂之一,并且三氟乙醇对酶活性和蛋白质稳定性的影响已经被很好地证明了。对酶活性和结构在有机溶剂中的变化已经做了广泛的研究。三氟乙醇是蛋白质折叠研究中常用到的潜溶剂,因为它能够在较低浓度时通过破坏疏水结构使蛋白质的三级和四级结构不稳定,而同时稳定二级结构的α螺旋和部分β折叠(浓度大于30%)。我们的研究提供了对三氟乙醇诱导的蛋白质结构变化的机理更清晰的认识。我们在三氟乙醇存在的情况下进行了对Cu/Zn-超氧化物歧化酶和酪氨酸酶的平衡态去折叠研究来详述对这两种酶的结构的理解。先前的研究中我们注意到三氟乙醇诱导的铜锌超氧化物歧化酶和酪氨酸酶活性和结构的变化,正如动力学折叠过程。用三氟乙醇研究酪氨酸酶和超氧化物歧化酶的结构及抑制机理,有助于为医药、美容等行业相关产品提供基础理论参考和累积科学资料。研究方法测定不同浓度三氟乙醇对酪氨酸酶的活性影响。而后保持底物浓度不变的情况下,改变三氟乙醇和酪氨酸酶的浓度,同样测定其活性,并作图对比判断抑制类型。改变三氟乙醇和底物的浓度,保持酶的浓度不变,测定数据作双倒数图,判断抑制动力学参数。使用不同高浓度的三氟乙醇,固定底物浓度和酶浓度,按照作用时间不同测定活性,绘制酶活性的抑制变化时间过程图。通过内源荧光和ANS结合荧光光谱学分析方法分析其三级结构特征。通过圆二色谱分析其二级结构变化。最后使用计算机模拟同源建模的方式,预测酪氨酸酶3D结构及其与三氟乙醇的结合位点。测定不同浓度三氟乙醇对铜锌超氧化物歧化酶的活性影响。而后保持底物浓度不变的情况下,改变三氟乙醇和铜锌超氧化物歧化酶的浓度,同样测定其活性,并作图对比判断抑制类型。使用不同浓度的三氟乙醇,固定底物浓度和酶浓度,按照作用时间不同测定活性,绘制酶活性的抑制变化时间过程图。改变三氟乙醇和底物的浓度,保持酶的浓度不变,测定数据作双倒数图,判断抑制动力学参数。通过内源荧光和ANS结合荧光光谱学分析方法分析其三级结构特征。通过圆二色谱分析其二级结构变化。最后使用计算机模拟的方式,预测铜锌超氧化物歧化酶与三氟乙醇的结合位点。结果1)三氟乙醇对酪氨酸酶的结构和功能影响研究在三氟乙醇浓度低于10%时,二级结构水平稍微增强；然而,随着三氟乙醇的浓度增加,所有的二级结构以剂量依赖性逐渐地减少。虽然三氟乙醇被认为可以稳定蛋白内的单环结构,而事实上减少了酪氨酸酶二级结构的程度。特别是在含有15%到25%的三氟乙醇的溶液里,二级结构的光谱改变显著的减少了,而在高浓度(25%至35%)溶液里,二级结构的光谱改变增加了。为阐明酪氨酸酶二级结构改变和活性间的关系,我们测定了在三氟乙醇存在时酪氨酸酶左旋多巴氧化活性。当三氟乙醇浓度低于10%时,酪氨酸酶活性保持不变,甚至稍微增强。当三氟乙醇浓度高于10%时,酪氨酸酶活性按剂量依赖性逐步减弱。为测定三氟乙醇介导的修饰的可逆性,通过做图对比了残留的活性。结果表明直线经过原点,确认了三氟乙醇对酪氨酸酶的抑制是可逆的。为评价抑制模型,进行Lineweaver-Burk图分析。显然的是Vmax和Km同时改变,二次做图采用斜率比较得到了抛物曲线,提示三氟乙醇诱导了抛物面的混合型抑制。通过计算所得KI=0.5±0.096 M(3.63±0.7%)和β=1.09。为评价失活动力学和速率常数,进行了时间相关测试。在10%三氟乙醇中酶活性未被灭活,只有在三氟乙醇浓度高于20%时活力以时间依赖性逐渐减少。这一结果与之前的结果完全吻合,在低于10%的三氟乙醇中酶活性的中间态未被灭活。随后的动力学分析通过对快慢灭活速率的半对数坐标图表明三氟乙醇对酪氨酸酶为二相性的灭活机制,其随TFE浓度增加的单向过程发展成两阶段的过程；抑制紧随着第一级动力学。通过分析TFE存在下酪氨酸酶三级结构改变。我们发现TFE诱导了酪氨酸酶内源性荧光光谱的改变,这随着波长的红移效果不断减弱。通过用对应不同浓度TFE的最高峰值波长的对比图得到了S型对应关系,这指出TFE诱导了酪氨酸酶三级结构的破坏。我们同时检测了ANS结合的荧光性变化；TFE显著增长了ANS结合荧光光谱,表明TFE使酪氨酸酶的疏水表面暴露。另外,这种增加是剂量依赖性的。三级结构改变由二级结构的调整引起,因此这种调整显示出与酶活性变化直接相关。由于酪氨酸酶的晶体结构未能阐明,我们按与酪氨酸酶25%、29%、26%和25%的序列一致性从PDB条目1wxc、1xom、2oic和2oid中选择模板结构,分别得,模拟了酪氨酸酶的3D结构。在酪氨酸酶的预测结构中,我们使用扩展到496A3的结合袋。三氟乙醇和酪氨酸酶以显著的分值(-2.25 kcal/mol by Autodock4 and-14.36 kcal/mol by Dock6)对接成功。使用Autodock4和Dock6,我们探索了三氟乙醇与酪氨酸酶距离接近的结合残端。我们发现最重要的与三氟乙醇相互作用的结合残端是与Autodock4一致的PHE170,THR175,VAL177,GLY251,PHE261和ASP536,和与Dock6一致的GLU250和ASP536;两套程序同时鉴定了ASP536。模拟结果支持之前观察到的斜坡抛物线混合型抑制,这种抑制类型在多结合位点的抑制剂中已经普遍检测到。2)三氟乙醇对铜锌超氧化物歧化酶的结构和功能影响研究我们在三氟乙醇诱导的去折叠平衡态测定Cu/Zn-SOD动力学数据。在三氟乙醇浓度低于20%时Cu/Zn-SOD活性保持不变,而当三氟乙醇浓度高于此值时Cu/Zn-SOD的以剂量依赖性逐渐失活,虽然还有部分活性残留。即使是60%的三氟乙醇只能抑制Cu/Zn-SOD不到40%的活性。这些结果表明Cu/Zn-SOD活性对三氟乙醇的瓦解能力具有相对抵抗力。为评估灭活动力学和速率常数,进行了时间间隔测量。描述了Cu/Zn-SOD在60%三氟乙醇中灭活的时间过程。酶活性随着作用时间的延长逐渐减少。微观灭活速率常数(ka)通过反应过程单相绘图的半对数表获得。60%三氟乙醇作用的速率常数为。这一结果表明无论三氟乙醇对Cu/Zn-SOD的灭活水平多低,这种灭活依然遵循一级动力学过程。在三氟乙醇存在的情况下通过内源荧光和ANS结合荧光测定Cu/Zn-SOD的三级结构变化,用以对比结构和活性的变化。内源荧光的变化显示了光谱明显的波峰红移,表明了三氟乙醇诱导的Cu/Zn-SOD明显的去折叠；随着三氟乙醇的浓度从0上升到60%,荧光波峰从330.5nm变化到336.5nm。以峰值波长与三氟乙醇浓度之间的关系作图显示S形关系。作图可得三氟乙醇去折叠Cu/Zn-SOD的动力学过程。半对数表显示去折叠过程遵循速率常量。这些结果表明Cu/Zn-SOD的去折叠过程与酶失活的过程同步。有趣的是,Cu/Zn-SOD活性在低于20%三氟乙醇中几乎无损失,并能够在这一浓度下保持稳定。然而,三氟乙醇对Cu/Zn-SOD几乎全部的结构改变发生在这个浓度,这表明三氟乙醇结合位点不再铜离子和锌离子介导催化反应的活性位点口袋中。此外,这些结果暗示了Cu/Zn-SOD的活性位点并不像其整个三级结构一样弹性多变。接下来我们来看在三氟乙醇存在的情况下Cu/Zn-SOD疏水表面的变化。针对三氟乙醇浓度的变化(5%-60%),ANS结合荧光以复杂的方式强烈变化。天然Cu/Zn-SOD具有相对较高的疏水表面直接应答ANS直接反应。不过在三氟乙醇介导的去折叠中,Cu/Zn-SOD的疏水表面并没有明显暴露。一般来说,ANS可以结合到疏水氨基酸残基,从而检测灭活剂处理后蛋白质的三级结构的破坏。实验发现在低于20%三氟乙醇作用时,显著减少了Cu/Zn-SOD的疏水表面,但当三氟乙醇浓度升至60%时,Cu/Zn-SOD的疏水表面几乎达到自然水平。随着TFE浓度的增加,整体α-螺旋结构呈现非剂量相关的形势。虽然已知TFE可稳定蛋白质内的螺旋结构,但它实际上减少了Cu/Zn-SOD的二级结构的程度。在222 nm的测量表明,随着TFE浓度增加整体螺旋含量以复杂的方式减少。TFE浓度增加到20%,螺旋含量比天然状态时下降至最少；当TFE浓度达到30%时,螺旋含量恢复到天然状态下螺旋含量的60%,然后随着TFE的浓度继续升至60%的过程中,螺旋含量又逐渐降低。Cu/Zn-SOD二级螺旋结构的变化伴随着疏水性变化；实验中20%的三氟乙醇对Cu/Zn-SOD的作用下,疏水性和二级结构发生明显变化。由于已有牛Cu/Zn-SOD的晶体结构(PDB ID:2SOD),我们可以直接构建Cu/Zn-SOD的3D结构。以显著性评分(-11.52 kcal/mol)成功使用DOCK6.3模拟Cu/Zn-SOD和三氟乙醇的结合,预测的与三氟乙醇相互作用的残基为THR37,ASP40和GLU119。模拟结果确认了实验中发现的三氟乙醇灭活Cu/Zn-SOD并不是通过直接和含有铜离子和锌离子的活性位点口袋相结合导致的。结论1)TFE可以导致铜锌超氧化物歧化酶的变性2)三氟乙醇诱导的铜锌超氧化物歧化酶结构变化中,活性位点的稳定性比其他部分结构的稳定性更高。3)低浓度TFE诱导了整体结构的变化,但活性位点仍然保持完整。4)计算机模拟三氟乙醇与铜锌超氧化物歧化酶结合中,再次证明了其结合位点不位于含有铜离子和锌离子的活性位点口袋中。5)TFE不直接与底物竞争,但会改变铜锌超氧化物歧化酶的三级结构。6)三氟乙醇与酪氨酸酶配体结合导致了酶活性的混合型抑制；7)酪氨酸酶二级结构改变原因是疏水表面的暴露；8)通过计算机模拟假定了三氟乙醇的结合残基；本研究为进一步研究酪氨酸酶和铜锌超氧化物歧化酶抑制剂提出了一种新对策。提供了计算机模拟抑制剂与酶结合的方法。