基于葡萄糖氧化酶稳定的铂纳米粒子多酶活性及自级联抗肿瘤作用的研究

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纳米酶与天然酶相比具有稳定性高、成本低、制备简单、易修饰等优点。同时,其可以利用肿瘤微环境如弱酸性和较高的H2O2含量等特点,特异性地对肿瘤细胞进行鉴别和杀伤,引起人们的广泛关注。葡萄糖氧化酶可以与细胞内的葡萄糖反应产生过氧化氢和葡萄糖酸,切断肿瘤的营养来源,然而其催化过程依赖于氧气,在低氧的肿瘤环境中其催化活性大大降低,无法实现高效抗肿瘤。而类过氧化氢纳米酶可以将肿瘤微环境中的过氧化氢转变为氧气,缓解肿瘤内部缺氧现象,因此可以将过氧化氢酶引入葡萄糖氧化进程,激活缺氧肿瘤中葡萄糖氧化酶的活性。在本研究中,我们利用铂纳米粒子的多种模拟酶活性,不仅缓解了肿瘤环境缺氧的问题,增强了葡萄糖氧化酶活性,而且还能产生活性氧实现协同抗肿瘤作用,提高抗肿瘤效果。第一章基于葡萄糖氧化酶为稳定剂的PtNPs的制备及其模拟酶活性的研究基于GOx与纳米酶的优良特性,我们制备了一种具有多重酶响应的葡萄糖氧化酶修饰的铂纳米粒子(GOx-PtNPs)。利用紫外-可见吸收光谱、Zeta电位及粒度分析仪、透射电子显微镜、X射线光电子能谱等对材料进行详细的表征,结果表明,GOx的表面基团能与PtNPs发生相互作用,从而有效稳定铂纳米粒子。进一步利用紫外-可见吸收光谱和便携式溶解氧分析仪探究了材料的多种酶性能。结果表明,GOx-PtNPs具有葡萄糖氧化酶活性和铂纳米粒子的类过氧化氢酶活性,类过氧化物酶活性和类氧化酶活性,可用于后续抗肿瘤活性研究。第二章基于葡萄糖氧化酶为稳定剂的PtNPs体外抗肿瘤活性研究鉴于第一章制备出具有多种模拟酶活性的GOx-PtNPs纳米酶,在细胞水平对GOx-PtNPs抗肿瘤活性进行研究。结果发现,GOx-PtNPs对正常细胞没有毒性,而对小鼠乳腺癌细胞(4T1)具有明显毒性,主要原因是肿瘤细胞比正常细胞代谢更加旺盛,产生更多的H2O2。在肿瘤微环境(p H 6.5)下,GOx-PtNPs可发挥其类过氧化氢酶活性产生O2缓解乏氧。另外,产生的O2在葡萄糖氧化酶的作用下,可消耗葡萄糖产生H2O2并导致体系的葡萄糖酸逐渐增加,一方面,通过消耗肿瘤环境内的葡萄糖抑制肿瘤增殖,另一方面,随着体系p H的进一步降低,该纳米酶可发挥其过氧化物酶和氧化酶的作用,将H2O2转化为毒性更强的羟基自由基,同时产生超氧阴离子进行协同抗肿瘤,构成自级联反应,可诱导4T1细胞凋亡。通过DCFH-DA对反应机制进行研究,可以观察到明显的活性氧信号,表明GOx-PtNPs通过活性氧的生成进行杀伤肿瘤作用。另外,溶血实验结果表明,生理条件下GOx-PtNPs不会引起红细胞破裂溶血,具有良好的血液相容性。第三章基于葡萄糖氧化酶为稳定剂的PtNPs体内抗肿瘤活性研究.在体外细胞研究的基础上,我们继续对GOx-PtNPs的体内毒性和抗肿瘤活性进行研究。对体内毒性进行评价后发现,不同浓度的GOx-PtNPs静脉注射14天后小鼠体重基本没有变化,另外,我们通过眼眶采血采集注射14天后的小鼠血液进行血常规分析,空白组和实验组的血常规测定结果均在正常参考值范围内,表明我们所合成的GOx-PtNPs具有良好的体内生物相容性。不同浓度GOx-PtNPs静脉注射14天后小鼠各组织器官H&E染色结果表明各组织器官均没有明显损伤,进一步验证该材料在体内具有良好的生物相容性。随后,我们发现注射GOx-PtNPs后肿瘤内H2O2浓度约为生理盐水的2.7倍,证明瘤内注射GOx-PtNPs后,GOx-PtNPs会发挥其过氧化氢酶活性和葡萄糖氧化酶活性,产生大量H2O2保证后续反应的进行。接着,通过瘤内注射生理盐水、GOx、Bare-PtNPs和GOx-PtNPs对小鼠进行抗肿瘤治疗研究材料的抗肿瘤活性,结果显示,与其他组别相比,GOx-PtNPs组可明显抑制瘤块生长,具有较好的抗肿瘤作用。
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