发生在植物体内的细胞程序化死亡(PCD)是植物生命周期中的一个重要组成部分?花作为植物的有性生殖器官,通常具有较短的生命周期,在花发育过程中存在着一个敏感而严密的细胞死亡程序调控花的生命活动?月季花是一种具有重要观赏价值和经济价值的花卉,它广泛应用于切花?本文以月季花的花瓣为实验材料,选取能够代表整个花发育过程的五个时期,从细胞核形态,核DNA,膜结构和功能的完整性,抗氧化酶,乙烯,蛋白质以及蛋白酶等几个方面对月季花瓣的PCD形态特征?生理生化以及分子生物学变化进行了系统的研究,以期探明月季花PCD机制,为延长切花寿命的研究提供理论依据? 具体研究结果如下: 1. 琼脂糖电泳显示,花发育后期基因组DNA被降解而产生阶梯状条带;通过荧光显微镜观察到花发育后期花瓣细胞体积缩小,原生质皱缩;用DAPI染色也显示细胞核在发育后期呈浓缩状态,并且原生质和细胞核的凝缩随花的发育进程而加重?这些形态学变化和DNA降解的阶梯状图谱都是典型的PCD特征? 2. 在月季花发育后期,伴随发育进程细胞膜透性增大,丙二醛含量升高,同时超氧自由基含量逐渐升高,细胞内主要的抗氧化酶 (SOD, POD和CAT) 在花发育后期活性降低,表明在花发育后期花瓣细胞膜受到过氧化伤害,膜结构和功能的完整性遭到破坏? 3. 花瓣细胞中可溶性蛋白质含量在发育前期(时期1,2)增加,后期减少,说明在花发育前期蛋白质以合成为主,在后期蛋白质降解?同样,构成染色体的组蛋白在发育后期也发生降解(主要是H2)?蛋白质降解而游离氨基酸并不相应增加,表明花发育过程中营养运输的库源关系的改变? 4. 月季花发育前期未检测到乙烯的释放,从时期3开始乙烯产生并随着发育时间的延伸而增加?乙烯的产生时期与花瓣PCD发生时期是一致的,表明乙烯作为一种发育信号或信使诱导PCD的形成?ACC和ACC合成酶活性的变化趋势与乙烯的变化完全一致?Northern 分析发现ACC合成酶基因在 1<WP=9>月季花发育过程中花瓣细胞程序化死亡机制研究发育后期(时期3,4和5)mRNA水平逐渐升高,与乙烯的升高趋势相一致?本实验首次通过外源乙烯诱导,使月季花瓣的ACC合成酶基因在时期2提前表达,表明ACC合成酶基因通过对乙烯合成的调控而参与花瓣PCD的调控? 5. 蛋白酶在发育后期其活性逐渐增强,蛋白酶活性的变化与蛋白质的降解是一致的,表明蛋白酶在花瓣PCD中的作用是参与蛋白质的降解? 本实验首次从月季花发育后期花瓣中克隆出半胱氨酸蛋白酶基因的片段(330bp)?用 RT-PCR 检测其表达,发现该基因的转录产物在发育后期表达,并且随着发育时间的延伸而增多,这意味着花瓣 PCD 过程中半胱氨酸蛋白酶活性的增强?表明半胱氨酸蛋白酶是参与花瓣 PCD 的一种主要的蛋白酶? 综上所述,月季花发育过程中花瓣的细胞程序化死亡机制是:发育信号诱导与 PCD 有关的基因表达,如半胱氨酸蛋白酶基因?ACC 合成酶基因,继而蛋白酶活性激发,同时乙烯大量产生,引起蛋白质降解,活性氧增加,抗氧化酶活性降低,膜脂过氧化,最终导致膜丧失完整性,DNA 降解,细胞结构和功能被破坏,细胞死亡?