牛产气荚膜梭菌病主要由A型、C型和D型产气荚膜梭菌引发,对畜牧业的危害极大,尚无有效的防控措施。本研究拟通过克隆及原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素基因、C型产气荚膜梭菌β2毒素基因及D型产气荚膜梭菌ε毒素基因,为研制基因工程疫苗奠定基础。临床分离鉴定牛源产气荚膜梭菌17株,经单因子毒素ELISA检测及多重PCR分型,最终鉴定出A型产气荚膜梭菌10株、C型产气荚膜梭菌4株、D型产气荚膜梭菌3株。通过小鼠半数致死量试验选择毒力强的菌株进行后续实验。克隆α、β2及ε毒素基因片段,构建克隆载体pMD18-T-α、pMD18-T-β2和pMD18-T-ε。将鉴定正确的基因片段分别插入到原核表达载体pET-32a(+)中,构建毒素基因原核表达载体pET-32a(+)-α、pET-32a(+)-β2和pET-32a(+)-ε,将构建正确的重组表达载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经IPTG诱导,Western blot检测表达蛋白的反应原性。结果表明,成功构建克隆载体pMD18-T-α、pMD18-T-β2和pMD18-T-ε,目的基因片段分别为 1092 bp、987 bp 和 798 bp。重组菌株 pET-32a(+)-α/BL21(DE3)、pET-32a(+)-β2/BL21(DE3)和 pET-32a(+)-ε/BL21(DE3)在 37℃,1mmol/L IPTG 诱导下可获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白大小分别为41 kDa、27 kDa和32 kDa,与预期大小一致。Western blot检测结果表明表达的α毒素蛋白、β2毒素蛋白及ε毒素蛋白具有良好的反应原性。综上所述,本研究成功构建出 pET-32a(+)-α/BL21(DE3)、pET-32a(+)-β2/BL21(DE3)和pET-32a(+)-ε/BL21(DE3)3株重组菌株,能良好表达α毒素蛋白、β2毒素蛋白和ε毒素蛋白,经Western blot检测证明表达的三种毒素蛋白均能与特异性抗体反应,具有良好的反应原性。