【摘 要】
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目的:研究酵母Whi2蛋白协同磷酸酶Psr1/2特异性感应低浓度亮氨酸信号并调节TORC1活性的分子机制。方法:免疫共沉淀:在酵母菌株中共转染含不同标签标记的目的蛋白质粒,研究TORC1信号通路中各蛋白之间的相互作用。细胞生长实验:通过观察在低浓度氨基酸培养条件下不同菌株的生长状况监测不同蛋白对细胞生长的影响。蛋白免疫印迹实验:利用Rps6的磷酸化水平检测酵母菌株在不同氨基酸条件下的TORC1活性
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目的:研究酵母Whi2蛋白协同磷酸酶Psr1/2特异性感应低浓度亮氨酸信号并调节TORC1活性的分子机制。方法:免疫共沉淀:在酵母菌株中共转染含不同标签标记的目的蛋白质粒,研究TORC1信号通路中各蛋白之间的相互作用。细胞生长实验:通过观察在低浓度氨基酸培养条件下不同菌株的生长状况监测不同蛋白对细胞生长的影响。蛋白免疫印迹实验:利用Rps6的磷酸化水平检测酵母菌株在不同氨基酸条件下的TORC1活性;用TAP标签标记内源性蛋白,检测蛋白的表达水平;利用prATG8-GFP,prATG8-GFP-ATG8自噬报道基因质粒观察酵母菌株在不同培养条件下的自噬诱导和自噬流情况。质谱实验:通过检测WT和Δpsr1Δpsr2中磷酸化多肽的情况,考察Psr1磷酸酶的修饰靶点。结果:免疫共沉淀实验显示,WT菌株和Δpsr1Δpsr2菌株中,Whi2与Tor1有相互结合作用。Whi2的功能失活型点突变体仍与Tor1有相互作用。截断型Whi2和Tor1突变体之间的免疫共沉淀实验显示,Whi2与Tor1的FAT和C端区域有相互作用。Whi2与磷酸酶Psr1/2之间有相互结合作用,且Whi2与失去磷酸酶功能的Psr1 D263/265E点突变体仍有相互作用,但失活型Whi2点突变体与野生型Psr1无相互作用。此外,Psr1与Psr2之间无相互结合作用,Tor1与磷酸酶Psr1之间也无直接的相互结合作用。细胞生长实验和蛋白免疫印迹实验显示,失去磷酸酶功能的Psr1 D263/265E点突变体不能抑制TORC1的活性和细胞生长,反而能提高TORC1活性并促进细胞生长。Psr1 D263/265E点突变体与Whi2有相互结合作用,且比野生型Psr1作用更紧密。质谱实验结果显示磷酸酶Psr1对Whi2没有去磷酸化修饰作用。通过prA TG8-GFP,pr4TG8-GFP-ATG8质粒检测细胞内自噬水平发现,在低浓度亮氨酸条件下,Whi2与Psr1/2能抑制TORC1活性从而促进自噬进程,并通过独立于TORC1的通路促进自噬诱导;但Whi2失活型点突变体与Psr1 D263/265E点突变体都不能抑制TORC1活性,也不能促进TORC1下游的自噬进程及自噬诱导。在无氮源条件下,Whi2与Psr1/2对TORC1活性没有抑制作用,但RAG GTPase信号通路中SEACIT复合物中的Npr2和Npr3仍能抑制TORC1活性;并且,Whi2与Psr1/2仍能通过独立于TORC1的途径诱导自噬,但Whi2失活型点突变体与Psr1 D263/265E点突变体均不能诱导自噬。通过蛋白免疫印迹检测TAP标签标记的内源性目的蛋白表达水平发现,在低浓度亮氨酸条件下,Whi2和Psr1蛋白的表达量逐渐升高;在无氮源条件下,Whi2和Psr1的表达量逐渐降低。而在低浓度亮氨酸和无氮源这两个条件下,Npr2与Iml1的表达量都无明显变化。结论:Whi2结合在Tor1的FAT区域和C端区域,并且此结合不依赖Psr1/2。Psr1/2与Whi2结合间接靠近Tor1,并依赖其去磷酸化修饰作用抑制TORC1的活性,但其修饰靶点并不在Whi2上。另外,失去磷酸酶功能的Psr1D263/265E点突变体能与野生型Psr1竞争性得与Whi2结合,从而促进TORC1的活性和细胞生长。Whi2、Psr1/2能特异性感应低浓度亮氨酸抑制TORC1活性,并促进其下游的自噬进程;但在无氮源条件下,TORC1活性仅通过SEACIT复合物被抑制。这与其调控因子在不同营养条件下的表达量变化有关。另外,在低浓度亮氨酸和无氮源条件下,Whi2依赖Psr1/2磷酸酶的作用,通过独立于TORC1通路的途径参与ATG8的诱导。
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