第一部分N-亚硝基-N-甲基脲诱导小鼠视网膜变性病变模型的特征目的：探讨N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)诱导的小鼠视网膜变性病变模型的形态、血管和电生理特征及其机制。方法：32只5周龄的C57/BL小鼠随机分为对照组和MNU造模组,造模组按60mg/kg腹腔注射给予N-亚硝基-N-甲基脲(MNU),对照组给予生理盐水。在给药后1d、2d、3d、5d、7d、2w、3w、4w和12w等不同时间点取视网膜标本。行冰冻切片免疫荧光染色,观察MNU诱导后光感受器细胞外节、双极细胞、细胞突触连接、神经节等的形念变化,以及线粒体损伤和光感受器细胞氧化损伤的情况。用免疫印迹(Western blot)检测蛋白表达水平。采用全视网膜铺片免疫荧光染色,观察神经节细胞的数量和视网膜血管的形态。采用透射电镜,观察光感受器细胞的盘膜、光感受器细胞的线粒体、视网膜各层细胞核和带状突触(synaptic ribbon)的超微结构改变。采用Ganzfeld ERG检测小鼠的全视网膜电生理改变。结果：给予烷化剂药物MNU后,采用免疫荧光染色。图片显示外核层(ONL)的厚度随给药后时间延长而逐渐减小,在一周内减少到只剩下2-3个细胞核层,用OPN1SW抗体标记光感受器细胞的外节,显示同样外节的渐进性丢失,提示位于视网膜外层的光感受器细胞对MNU引起的损伤最为敏感。10%的样本出现后极部比周边部的外节损伤更严重的现象。用蛋白激酶Ca (PKCa)抗体标记双极细胞,给药后时间延长树突呈现逐渐的回缩,突触后致密蛋白95(PSD95)抗体标记的光感受器细胞内侧端末梢也逐渐丢失,提示外丛状层(OPL)的细胞间突触连接受到破坏。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体标记的Muller细胞增生非常明显,肥大的Muller细胞包裹受损的神经元细胞,遍及整个视网膜细胞层,提示免疫机制被启动。在外核层,与对照组相比,给MNU后, Nitrotyrosine抗体标记的硝基酪氨酸和S-Nitroso-Cysteine抗体标记的亚硝基化半胱氨酸的荧光信号明显增多,提示MNU能导致外核层的氧化损伤。热休克蛋白60(HSP60)是线粒体的常用标记物,给MNU后,观察到光感受器的线粒体逐渐丢失,给MNU后第3天,信号就完全消失；在内核层,HSP60抗体标记的线粒体荧光信号减少,但在给MNU后一周并未完全消失；线粒体损伤提示光感受器细胞的凋亡。无论是在免疫荧光切片还是铺片上,Brn-3a抗体标记的神经节细胞的数量均并未见无明显丢失。扫描电子显微镜显示,给予药物MNU后一周,光感受器细胞的核呈浓染色；给予MNU后3天内,光感受器细胞线粒体不同程度的肿胀,给MNU后5-7天,线粒体消失。给MNU后一周,光感受器下游的双极细胞核周间隙增宽,在双极细胞胞浆中有大量的自噬体。浓染核、线粒体肿胀和自噬体都是细胞凋亡的典型标记。此外,还在电镜下观察了视网膜特有的带状突触结构,在对照组的外丛状层,观察到大量典型的带状突触,给药MNU后第3天,数量大量减少,残存的少量带状突触其长度变短,边缘模糊,周边缺乏典型的水平细胞和双极细胞的内陷末梢结构。在电镜下,在给MNU后一周的样本中,未观察到内丛状层(IPL)和神经节细胞层(GCL)的明显变化。用Isolection IB6荧光染色显示的视网膜血管结构,给MNU后,大分支血管壁结构逐渐遭到破坏,末梢还出现大量血管丛样结构。Weastern Blot显示GFAP表达水平在给MNU后一天即上升,7天达高峰；全视网膜的HSP60和细胞色素C氧化酶亚基IV (COX4)的水平下降约1/5,提示给MNU后一周内,光感受器的线粒体受到损伤,内侧其他视网膜细胞的线粒体尚存。给MNU后第3天,全视野ERG结果显示：最大混合反应的a波和b波波幅均明显下降。结论： MNU诱导模型主要导致光感受器细胞的丢失,并继发视网膜神经组织的结构重塑,其凋亡的机制可能是通过氧化损伤,该模型为研究RP和干性AMD等视网膜变性性疾病提供了有价值的动物模型。第二部分大麻素受体1抑制剂SR141716A缓解MNU诱导视网膜变性病变模型的光感受器损伤目的：研究大麻素受体1抑制剂SR141716A (SRI)缓解MNU诱导视网膜变性病变模型的光感受器损伤及机制。方法：造模组按50mg/kg腹腔注射给予N-亚硝基-N-甲基脲(MNU),对照组给予生理盐水和DMSO,干预组给于大麻素受体1和2的非特异性抑制剂WIN55,212-2(WIN)或SR1或SR144528(SR2).按照给药的药物成分,30只5周龄的C57/BL小鼠随机分为以下七组：MNU组、WIN组、SR1组、MNU+WIN组、MNU+SR1组、MNU+WIN+SRl组MNU+WIN+SR2组,观察给MNU后3天、5天、7天早中晚三个时期SR1对MNU造成的外核层损伤的影响。视网膜切片免疫荧光染色,显示大麻素受体1(CB1)在视网膜各层的分布。免疫荧光双标法显示CB1在视网膜各层细胞上的表达情况。急性分离细胞免疫荧光观察单个双极细胞上大麻素的表达。Real-time PCR定量观察大麻素受体mRNA水平的表达。免疫荧光染色观察给大麻素药物后光感受器厚度变化和胶质增生。全视网膜铺片免疫荧光染色血管显示血管损伤。薄片膜片钳技术记录ON型和OFF型双极细胞的对各种药物的电生理反应。结果：免疫荧光结果显示CB1在视网膜是有表达的,CB1在视网膜外丛状层和内丛状层的表达最为明显。用抗体OPN1SW、PKC a、Brn3a和GFAP分别标记光感受器细胞外节、双极细胞、神经节细胞的核和Muller细胞,分别与CB1抗体行免疫荧光双标,提示CB1在光感受器细胞外节、内核层双极细胞的胞体和神经节细胞的胞体也是有表达的,在Muller细胞上没有表达。急性分离的双极细胞用PKC α和CB抗体行免疫荧光双标,证实了双极细胞上的确有CB1的表达. Real-time PCR结果显示：MNU损伤后,大麻素受体1的基因表达量无变化,大麻素受体2基因表达上调。单独给WIN或WIN+SR1或WIN+SR2干预没有改善作用。单独给SR1干预有改善作用。与MNU组比较,MNU+SR1的外核层厚度更厚,胶质增生不明显。全视网膜铺片免疫荧光染色血管显示：MNU+SR1组的大血管损伤轻,只见少量的异常末梢血管丛。薄片膜片钳技术记录：ON型视杆细胞对MNU的损伤比OFF型双极细胞更敏感。SR1能部分缓解MNU诱导的光感受器损伤和及其对下游双极细胞的影响。结论：SR1能缓解MNU诱导视网膜外层变性模型的光感受器损伤。