【摘 要】
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自从2019年12月8日爆发严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）,疫情迅速传播至全国,并在世界范围内传播。在迅速传播的过程中,产生了众多的突变株并造成了大量人口的死亡。因此急需对SARS-CoV-2病毒的复制动力学特征和病毒侵染能力进行研究。新冠突变株复制动力学研究:使用Vero-E
【基金项目】
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军队高层次创新人才项目； 山西省高等教育“1331工程”重点创新团队提质增效建设计划项目（20211331-13）；
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自从2019年12月8日爆发严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2）,疫情迅速传播至全国,并在世界范围内传播。在迅速传播的过程中,产生了众多的突变株并造成了大量人口的死亡。因此急需对SARS-CoV-2病毒的复制动力学特征和病毒侵染能力进行研究。新冠突变株复制动力学研究:使用Vero-E6对临床分离SARS-CoV-2AMSO株（Accession No.MT291831）进行传代的过程中发现了一株TCID50/m L极高的毒株,对其进行了低感染量（MO1≈0.001）的6次连续传代后,将其与原始非突变株在Vero-E6细胞上的复制动力学进行了比较,首先分别接种2种病毒,实时荧光定量PCR检测病毒感染后24h、48h、72h、96h4个时间点细胞上清液ORF1ab基因拷贝数及相应时间点细胞培养病毒上清的TCID50/m L,结果表明:检测细胞上清液的拷贝数未发现规律性的差异。其次,检测了接毒量MOI为0.01时,感染后的TCID50/m L,每一时间点突变株的TCID50/m L明显高于原始毒株,差异极显著（P＜0.001）,并且于接毒后72 h,二者存在约10~3倍的差距。最后,对突变株培养后经RT-PCR获得S基因片段,将其连接到载体,对其进行序列测定,并与原始株S蛋白氨基酸序列进行比对,结果其多个氨基酸位点发生了突变,且弗林酶酶切位点序列处发生了缺失,推测该突变株具有较高的TCID50/m L,可能与弗林蛋白酶切割位点处发生缺失有关。岩藻糖化修饰对SARS-CoV-2侵染能力和复制的影响:SARS-CoV-2的S蛋白表面具有复杂的糖基化修饰。为此,该研究通过SARS-CoV-2感染岩藻糖转移酶8（FUT8）缺失细胞系和经岩藻糖转移酶合成抑制剂处理获得的岩藻糖合成能力缺失/下降的细胞系,获得了相应的SARS-CoV-2岩藻糖缺陷型病毒,并对感染Vero-E6细胞后不同时间点的病毒滴度(TCID50/m L)和病毒基因的拷贝数（ORF3基因）进行检测,研究岩藻糖化修饰对SARS-CoV-2侵染能力和复制的影响。FUT8缺失细胞系获得的岩藻糖缺陷型病毒的研究,在构建FUT8缺失细胞系基础上,SARS-CoV-2南非株和BMA8鼠适应株分别感染FUT8缺失细胞系并获得相应岩藻糖糖基化缺陷型病毒,将获得的两个变异株。检测病毒感染后48 h和72 h细胞上清TCID50/m L的变化,研究岩藻糖糖基化缺失对SARS-CoV-2侵染能力的影响,结果表明:南非变异株和BMA8鼠适应株的变异株,与其相应的原始毒株相比,在感染48 h和72 h后病毒滴度均有所下降,差异显著（P＜0.05）。岩藻糖基化缺陷型病毒的感染能力与原始毒株相比TCID50/m L下降了10～100倍,推测该结构的缺失对于SARS-CoV-2病毒的侵染能力有着十分重要的影响。岩藻糖合成抑制剂处理细胞获得的岩藻糖合成能力下降的细胞系对病毒侵染与复制能力的影响:分别用2F-过乙酰基-岩藻糖（2FF）和2-脱氧-2-氟-L-岩藻糖（2FP）2种岩藻糖合成抑制剂与Vero-E6细胞作用,获得了岩藻糖合成能力下降的细胞系,在验证2种抑制剂对细胞活力和病毒无直接的抑制和杀灭作用的基础上,SARS-CoV-2南非株和BMA8鼠适应株分别感染此细胞系,并获得相应岩藻糖糖基化缺陷型病毒,检测感染后48 h和72 h收取的细胞上清液的TCID50/ml。荧光定量PCR法检测了胞内ORF3基因的拷贝数,以检测岩藻糖糖基化缺陷型病毒复制能力。结果表明:2FF抑制剂处理细胞感染获得的南非变异株和BMA8鼠适应株的变异株与其相应的原始毒株相比,于感染后48 h和72 h病毒滴度均有所下降,南非变异株差异极显著（P＜0.001）,而BMA8鼠适应株变异株与于感染后72 h差异极显著（P＜0.001）。2FP处理细胞感染南非变异株和BMA8鼠适应株的变异株与其相应的原始毒株相比,于感染后48 h和72 h病毒滴度均有所下降,感染48h后差异极显著（P＜0.001）,感染72h后差异显著（P＜0.01）,与上述结果一致,推测该结构的缺失对于病毒的侵染能力很重要。荧光定量PCR法检测感染12 h、48 h和72 h后胞内SARS-CoV-2 ORF3基因组的拷贝数结果表明,各组变异株与其相应原始毒株相比,因组拷贝数没有明显的变化。推测该结构的缺失对于新冠病毒病毒的复制没有明显的影响。综上所述,本研究发现了1株新冠病毒突变株,通过研究其与原始株体外增殖能力的差异,说明获取的突变株病毒滴度显著高于原始毒株。通过研究岩藻糖基化对病毒侵染能力的影响表明,岩藻糖基化对于新冠病毒侵染细胞有着重要的作用,而对病毒的复制影响不大。本文的结果为新冠病毒致病机制以及相关抗病毒药物的筛选及研发,新冠病毒患者的治疗提供了新的思路和方向。
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