疟疾是严重危害人类健康和生命的重要传染病之一。据2019年世界疟疾报告报道,2018年全球共有2.28亿病例,死亡人数为40.5万人。2018年大多数疟疾病例发生在世界卫生组织(WHO)非洲地区(2.13亿,占93%),其次是WHO东南亚地区,占3.4%,WHO东地中海地区,占2.1%。在死亡病例中,5岁以下的儿童是受疟疾影响最大的群体,他们占全世界所有疟疾死亡人数的67%(27.2万)。恶性疟原虫是非洲地区最流行的疟原虫,占2018年病例总数的99.7%。在全球范围内,间日疟原虫在东南亚区域占53%,其中大部分在印度(47%)。间日疟原虫是美洲地区的主要寄生虫,占疟疾病例的75%。间日疟原虫与恶性疟原虫相关研究证明,减毒子孢子免疫后可以在人和实验动物中产生良好的保护力。但是如何大规模生产、保存以及运输等问题一直无法解决,从而影响了开发推广。间日疟原虫GPI锚定的微线体抗原(PvGAMA)可以与Duffy阳性和阴性血型的红细胞结合,其同源蛋白恶性疟原虫GPI锚定的微线体抗原(PfGAMA)也可以结合红细胞,并且其特异性抗体能够成功抑制恶性疟原虫入侵红细胞,但尚未揭示红细胞上的受体。因此寻找疟原虫黏附分子的红细胞膜表面受体不仅仅有助于阐明疟原虫的侵入机制,同时也对疟疾疫苗的研制有着至关重要的作用。本研究将揭示恶性疟原虫、间日疟原虫如何侵入红细胞的机理为基本目标,通过阐明PfGAMA、PvGAMA蛋白结合红细胞的关键分子及其复合体的功能,最终为完善恶性疟、间日疟疫苗研发策略提供理论基础。本研究主要包括三部分工作:第一部分,GAMA红细胞结合区域原核表达质粒的构建及重组蛋白的表达纯化。首先将PfGAMA和PvGAMA红细胞结合区域(PfGAMA Tr3和PvGAMA F2)基因密码子优化到大肠杆菌表达系统,我们采用In-fusion克隆技术将PfGAMA和PvGAMA基因构建到pET30a大肠杆菌表达载体;通过原核表达系统对构建成功且测序正确的质粒进行诱导表达,并采用镍柱亲和层析的方法对粗蛋白进行纯化,最后制备出浓度大于1 mg/ml且纯度高于80%以上的PfGAMA和PvGAMA蛋白备用。第二部分,GAMA与人红细胞膜蛋白相互作用。我们通过低渗Tris-HCl缓冲液破红细胞的方法提取人红细胞膜蛋白,蛋白浓度用BCA蛋白含量检测试剂盒定量。接着采用镍柱串联亲和层析法筛选与PfGAMA结合的人红细胞膜蛋白,对镍柱洗脱下来的结合蛋白复合物进行银染,以鉴定差异条带。切割差异带进行脱色、酶解和脱盐步骤,最后将肽段进行质谱检测得到位于红细胞膜表面的蛋白的只有Ankyrin-1蛋白,且质谱预测出Ankyrin-1蛋白中的肽段最多(7段),综合评分最高(154.62)。第三部分,GAMA与Ankyrin-1相互作用。根据文献对Ankyrin-1蛋白功能区域划分,将N端的膜结合区域通过部分区域重叠的方式划分为3个区域,并通过In-fusion克隆技术将3段基因克隆到pET30a表达载体,并采用镍柱亲和层析的方法对粗蛋白进行纯化,制备出浓度大于0.9 mg/ml且纯度高于80%以上的Ankyrin-1-D1(46 kDa)、D2(47 kDa)、D3(48 kDa)。通过Flag Pull-down筛选Ankyrin-1与PfGAMA、PvGAMA的结合区域。Pull-down结果表明PfGAMA、PvGAMA的三个结合洗脱液中均验证出与其结合的是Ankyrin-1-D2。通过对免疫印迹的结果图中条带进行灰度值测算得出HA标签抗体验证结合蛋白洗脱液中Ankyrin-1-D2的灰度值最高,即蛋白洗脱液中Ankyrin-1-D2蛋白量最高。接着通过提取恶性疟原虫虫体蛋白与Ankyrin-1-D2相互作用,结果显示Ankyrin-1-D2可以与天然PfGAMA相互作用。酶处理Ankyrin-1-D2与GAMA结合证实了Ankyrin-1是糜蛋白酶依赖性受体。细胞实验证实了Ankyrin-1-D2抗体可以有效地抑制GAMA与红细胞结合。最后通过验证蛋白相互作用的金标准“表面等离子共振技术”检测PfGAMA、PvGAMA与Ankyrin-1-D2互作亲和力大小的方法进一步证实了PfGAMA、PvGAMA与Ankyrin-1-D2相互作用。综上所述,本研究筛选出疟原虫GAMA蛋白在红细胞上的特异性结合受体均为Ankyrin-1,揭示了GAMA蛋白在疟原虫入侵红细胞的重要功能,为完善恶性疟原虫和间日疟原虫的疫苗的开发,特别是重组亚单位疫苗的开发提供了理论依据。