自噬(autophagy)是一种在进化上保守亚细胞水平的自我吞噬，是胞内脂双层膜包裹细胞器和胞浆蛋白形成“自噬体”，随后自噬体膜和溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解胞内的细胞质及细胞器，释放氨基酸和游离脂肪酸从而实现细胞的自身代谢和细胞器更新。在应激条件下肿瘤细胞往往利用自噬提供的必需能量物质促进肿瘤的细胞生长，抑制肿瘤细胞自噬产生凋亡，是治疗肿瘤的一个可行性策略。氯喹（Chloroquine,CQ）是美国食品药物管理局批准用于抗疟疾和类风湿的药物。近年来，发现CQ靶向溶酶体途径抑制肿瘤细胞的自噬，是常用的自噬抑制剂。临床Ⅰ期和Ⅱ期实验证明CQ促进肿瘤细胞凋亡，并显著提高肿瘤细胞对放化疗的敏感性。但是，有报道在一些实体肿瘤模型中CQ没有抗肿瘤细胞作用，例如肿瘤酸性微环境妨碍CQ进入溶酶体发挥作用，从而抑制CQ的抗肿瘤作用。最近有报道CQ通过激活P62、JNK介导的NF-κB信号通路部分抵消它抗肿瘤作用。说明CQ抗肿瘤作用可能和肿瘤的微环境有关。　　实体瘤中肿瘤细胞在无限制的增殖时常常面临低氧，饥饿，代谢产生酸性环境和内质网应激（ER应激）等。ER应激是保护和代偿机制，主要表现为未折叠蛋白反应（UPR），糖调节蛋白78KDa(GRP78)是UPR中最关键的蛋白。在内质网应激时。胞质蛋白GRP78表达增高和GRP78定位到肿瘤细胞表面,胞质GRP78和肿瘤细胞膜GRP78与其增殖和存活密切相关。肿瘤细胞膜GRP78与一些信号分子（蛋白激酶抑制剂α2-巨球蛋白等）和蛋白形成复合体传递肿瘤发生信号，促进肿瘤细胞增殖和恶性发展。所以，我们假设肿瘤细胞内质网应激诱导GRP78表达增多和膜定位减弱CQ抗肿瘤作用。GRP78是内质网常驻蛋白，没有经典的跨膜结构，GRP78到底是通过什么途径定位到细胞膜上。有研究表明GRP78定位到细胞膜可能依赖蛋白分泌的经典途径，即内质网到高尔基体运输的蛋白经典分泌途径。Brefeldin A（BFA）特异性阻断内质网到高尔基体的蛋白经典分泌途径，从而诱导内质网应激，是常用的内质网应激诱导剂。但是我们发现BFA处理后定位到细胞膜上GRP78仍然增多，说明内质网应激情况下，GRP78定位到细胞膜上不依赖蛋白质分泌的经典途径的，在具体机制目前不清楚，我们课题组有文章报道BFA诱导自噬，我们又假设自噬参与GRP78定位到细胞膜上和细胞外分泌。　　目的：　　1、证实内质网应激诱导GRP78表达增多和膜定位抑制CQ抗肿瘤的效果；　　2、明确自噬是否参与GRP78定位到细胞膜以及细胞外分泌。　　方法:　　1、体内试验：先制作宫颈癌移植瘤模型，用BFA诱导肿瘤组织内质网应激（ER应激），用Western blot检测组织蛋白GRP78和自噬标志蛋白LC3表达，证实造模成功。检测ER应激时CQ对肿瘤生长影响；　　2、体外实验：在ER应激时，Western blot检测CQ对凋亡相关蛋白、GRP78和LC3表达的影响。；　　3、EGCG抑制GRP78表达或者A-10抗体封闭细胞膜GRP78时，分别用Western blot检测、MTT法检测、细胞划痕实验检测CQ分别对肿瘤细胞的凋亡、迁移以及细胞增殖的影响。　　4、Western blot方法、细胞免疫荧光检测和流式细胞术检测检测自噬对BFA诱导肿瘤细胞GRP78膜定位的影响；用不同肿瘤细胞检测。　　结果:　　1、制作宫颈癌模型成功，在体内实验显示：BFA和CQ组单独使用时，与对照组相比肿瘤体重和体积明显较小，但是BFA+CQ联合组与对照组相比肿瘤体重和体积没有显著性差异；HE染色未见明显坏死灶；Western blot检测结果发现BFA组、BFA+CQ联合组与对照组相比GRP78和LC3II蛋白的表达量增高。　　2、体外实验结果显示:在TC-1、HeLa细胞中，Western blot检测结果发现BFA组、BFA+CQ联合组与对照组相比GRP78和LC3II蛋白的表达量增高，而且BFA+CQ联合组与BFA组相比LC3II蛋白的表达量增高，四个处理组Cleaved Caspase12和Cleaved Caspase3表达情况没有显著区别,然而BFA+CQ联合组与CQ组相比Cleaved Caspase8表达量减少。　　3、在TC-1、HeLa细胞中，Western blot检测结果发现CQ+EGCG联合组与CQ组相比Cleaved Caspase3表达量增高；划痕实验结果发现CQ+EGCG联合组、CQ组与对照组相比细胞迁移的速率下降，但是CQ+EGCG联合组与CQ组相比细胞迁移的速率显著下降(TC-1P值0.001,HeLa P值0.03)；MTT检测的结果中发现在HeLa细胞药物处理24h，四个处理组对细胞增殖影响没有显著的差别；在处理48h、72h时，CQ+EGCG联合组、CQ组与对照组相比细胞的增殖受到抑制，而且CQ+EGCG联合组与CQ组相比细胞增殖抑制更加明显。GRP78A-10处理也是同样的效果(TC-1P值0.001,HeLa P值0.045)。说明EGCG或者GRP78A-10增强CQ诱导TC-1和HeLa细胞的凋亡以及增强CQ对TC-1和HeLa细胞增殖、迁移的抑制　　4、在TC-1、HeLa细胞中，Western blot检测结果发现均为BFA+CQ联合组、BFA组与对照组相比的细胞膜GRP78蛋白表达量增高，CQ组与对照组相比没有明显差别，而且BFA+CQ联合组与BFA组相比细胞膜GRP78蛋白的表达量减低。细胞免疫荧光的结果也是一样，BFA+CQ联合组与BFA组相比GRP78的表达量减低。在HeLa、A549和H1915细胞，流式细胞术结果发现3-MA+BFA联合组FITC标记GRP78抗体结合的细胞数与BFA组相比较少，CQ也是同样的效果，抑制了BFA诱导的GRP78定位到细胞膜上。Western blot验证MEFATG5(-)与MEFATG5(+)细胞ATG5的表达与所标的一致，在MEFATG5(-)和MEFATG5(+)细胞中也是BFA+CQ联合组与BFA组相比细胞膜GRP78表达减少。而且MEFATG5(-)细胞BFA+CQ联合组与MEFATG5(+)细胞中BFA+CQ联合组相比细胞膜上GRP78表达减少。说明敲除小鼠成纤维细胞自噬相关基因ATG5减少GRP78定位到细胞膜上，同样也抑制BFA诱导的GRP78定位到细胞膜上。Western blot检测培养基蛋白结果发现在TC-1细胞BFA+CQ联合组与BFA组相比GRP78表达增多，HeLa细胞在各组中都没有分泌GRP78蛋白。在MEFATG5(-)细胞与MEFATG5(+)细胞中Western blot检测结果发现BFA+CQ联合组与BFA组相比GRP78胞外分泌减少，而且MEFATG5(-)细胞BFA+CQ联合组与MEFATG5(+)细胞中BFA+CQ联合组相比GRP78胞外分泌减少。总而言之，在TC-1细胞中，自噬抑制剂促进BFA诱导的GRP78胞外分泌；但是有趣的是，在小鼠成纤维细胞中敲除ATG5减少BFA诱导小鼠成纤维细胞的GRP78的分泌。　　结论:　　1.GRP78抑制自噬抑制剂CQ的抗肿瘤作用；　　2.自噬参与GRP78定位到细胞膜上和向细胞外分泌的过程。