【背景】各种原因造成的骨折、骨不连、骨缺损及骨愈合延迟等一直是威胁人类健康的医学难题。在世界范围内,每年仅骨质疏松症引起的骨折就超过890万。在骨科系统损伤中,约有5-10%病例存在骨愈合问题最终导致不能正常愈合,而需要外部干预促进骨生长愈合。促进骨愈合、骨再生及修复是目前亟待解决的问题。间充质干细胞（mensenchymal stem cells,MSCs）是具有自我更新和分化潜能的细胞,在一定的诱导条件下,间充质干细胞可定向分化为成骨细胞,是骨愈合的关键。而调控MSCs向成骨细胞的分化可应用于骨修复中促进骨形成、骨再生及骨愈合,故间充质干细胞成骨分化的调控机制是骨再生及修复研究的重点科学问题。目前神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）为骨再生重塑机制研究中的最新热点之一。骨折伴颅脑损伤后骨折愈合较单纯骨折加速的现象已在临床得到证实及普遍认同;实验性颅脑损伤大鼠在颅脑损伤15分钟后即出现NPY浓度的增高,NPY与骨折愈合加速之间的关系值得探讨。明确NPY与骨折愈合及MSCs成骨分化的相关性,不仅将阐明NPY参与骨折愈合的可能机制,且为骨再生修复及临床治疗等明确靶点基因及提供新策略,在细胞生物疗法和组织再生工程等领域具有重要的临床应用价值。【研究目的】通过对长骨骨折伴颅脑损伤临床患者与单纯长骨骨折临床患者比较血清NPY水平及骨折愈合速度,分析患者体内NPY水平与骨折愈合速度及MSCs成骨分化的相关性;进一步体外分离培养健康人骨髓MSCs,应用细胞生物学、分子生物学、生物化学等手段,比较体外NPY刺激诱导下MSCs向成骨细胞分化的状态;并探讨NPY调控的MSCs成骨分化的分子机制。明确此机制为骨髓MSCs及调控因子在骨愈合修复治疗及在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的应用提供广阔前景。【研究方法】1.相关病例信息收集及分组:本研究经第二军医大学生物医学伦理委员会批准,所有患者及健康志愿者自愿签署知情同意书。研究通过前期对临床中发现的问题进行选题立题:即对临床中脑损伤伴骨折患者骨折愈合加速现象加以分析。研究收集了收集80例相关病例的信息及标本,进行了前瞻性研究。研究对病例和对照组进行严格的性别、年龄匹配,降低干扰因素。按国际上格拉斯哥昏迷指数（Glasgow Coma Scale、GCS）来确定颅脑损伤严重程度,对患者进一步分组;收集患者骨折后1天（24小时）、3天、7天、10天、2周及4周时的外周血（血清）。对不同时期的NPY水平及于进行其他相关参数进行检测,并对每组患者之间的差异进行比较分析。2.分析NPY是否与骨折愈合加速相关性:收集单纯长骨骨折患者20例及长骨骨折伴颅脑损伤患者60例（共80例）及10例正常对照的信息及血清标本,并对NPY及其他骨折愈合相关参数进行检测,对每组患者之间的差异进行分析。检测分析比较单纯骨折组与骨折伴颅脑损伤组的骨折愈合速度:对2组患者（单纯组;合并颅脑损伤组）骨折后不同阶段,采用日立917分析仪及Immunite 2000分析仪检测并比较2组血清骨修复阶段的愈合标志ALP及OC的活性及水平;放射免疫法检测并比较2组血清骨修复阶段愈合标志PICP及ICTP的蛋白水平。并Sep-Pac C18萃取后应用放射免疫法检测分析2组患者外周NPY蛋白水平的差异:对2组患者（单纯组、合并颅脑损伤组）骨折后不同阶段,采用放射免疫法检测及比较2组患者血清NPY水平;并分析NPY与颅脑损伤程度的相关性。3.检测分析增高的NPY来源:收集颅脑损伤者脑脊液检测NPY水平。放射免疫法检测并比较脑脊液中NPY水平与外周血中NPY水平,通过差异判断NPY来自脑脊液的可能性。同时应用定量PCR对2组患者外周全血单核细胞的NPY的m RNA水平进行比较,以进一步排除NPY来源于外周血的可能。4.健康人骨髓间充质干细胞分离、培养、传代、及鉴定:明确健康人间充质干细胞的原代细胞分离、培养、传代方法;观察细胞形态及生长状态;人间充质干细胞通过流式细胞仪表型鉴定。5.细胞骨钙质沉积检测:通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红S（Alizarin Red S）染色及观察细胞形态,对成骨分化培养液诱导的间充质干细胞及NPY诱导后间充质干细胞的钙质沉积变化进行检测,对于间充质干细胞成骨分化状态进行分析。6.分子生物学及生化学手段定量NPY诱导下间充质干细胞的成骨分化转录因子Runx2的m RNA及蛋白水平变化:利用定量PCR对Runx2进行定量检测,分析不同剂量NPY与下游Runx2的m RNA相关性;利用western blot方法对Runx2进行蛋白定量检测,分析其与NPY诱导间充质干细胞成骨分化与Runx2在蛋白表达水平上的相关性。7.定量PCR检测NPY诱导下间充质干细胞膜Y1受体（NPY1R）的m RNA水平变化:利用定量PCR对不同剂量NPY及刺激时间与NPY的细胞膜Y1受体的相关性进行定量检测,分析其与NPY诱导间充质干细胞成骨分化与NPY1R的m RNA表达水平的相关性。【结果】本研究对单纯长骨骨折患者组与长骨骨折伴颅脑损伤患者组的骨折愈合速度、外周血NPY水平及来源等进行了检测分析,发现:1)与单纯骨折相比,骨折伴脑损伤组患者的骨折愈合标志ALP、OC、PICP及ICTP均显著增高;2)骨折伴颅脑损伤组患者的外周血NPY水平在骨折后24小时开始即显著增加,至7天后仍有显著统计学差异;提示伴有颅脑损伤患者的骨折愈合加速与体内血清高水平的NPY相关。3)骨折伴颅脑损伤组的患者脑脊液及外周血NPY水平未见明显不同,除外NPY外周来源的可能性;4)进一步检测发现单纯骨折组及骨折伴颅脑损伤组的外周血单核细胞的NPY的m RNA水平未见明显不同。提示NPY可能来源于脑脊液。5)采取人骨髓,并成功对人骨髓间充质干细胞进行体外分离培养、传代及流式细胞仪表型鉴定表型鉴定及钙质沉积ALP和茜素红染色检测。6)应用分离培养成功的人骨髓间充质干细胞,在体外观察到NPY刺激下,间充质干细胞的Runx2的m RNA及蛋白水平均增加,并与NPY剂量呈正相关;7)在体外NPY刺激的人骨髓间充质干细胞的NPY的受体Y1（NPYR1;NPY1R）的m RNA水平增加,与NPY剂量呈正相关,并与刺激后培养时间呈依赖相关。【结论】人体in vivo研究表明:1)骨折伴颅脑损伤组的骨折愈合速度加快与外周血的高水平的NPY显著相关;2)外周高水平的NPY可能通过损伤的血脑屏障来自脑脊液;3)除外高水平的NPY来源于外周的可能性。健康人骨髓间充质干细胞in vitro实验结果表明:1)NPY可能通过成骨分化转录因子Runx2来诱导间充质干细胞成骨分化;2)NPY能够上调其Y1受体的m RNA水平。本研究推测:NPY在体内可能直接结合细胞膜Y1受体,并通过调控Runx2的表达来诱导间充质干细胞成骨分化,进而加快骨折愈合。此研究成果不仅发现间充质干细胞成骨分化的新机制,且对间充质干细胞及调控因子在骨再生修复治疗的应用、间充质干细胞在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的应用均有重大意义。